Фазово-контрастная микроскопия.
Метод основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, тем не менее способны изменять фазу проходящих через них лучей. Фазово-контрастная микроскопия осуществляется благодаря разности фаз, возникающих при прохождении света через живые объекты.
Люминесцентная микроскопия.
Метод основан на способности некоторых клеток и красителей светиться (люминесцировать) при попадании на них ультрафиолетовых или: других коротковолновых лучей света. Для люминесцентной микроскопии используется обычный световой микроскоп с источником лучей ультрафиолета или генератором других коротковолновых лучей спектра. Большинство микроорганизмов не обладают флюоресценцией, поэтому их окрашивают красителями – флюорохромами: акридин, аурамин, корифосфин и др.
Электронная микроскопия
В электронном микроскопе вместо света использован поток электронов.
Для определения деталей структуры микроорганизма используют методы:
1. Метод напыления. На поверхность препарата напыляют тонкий слой
(7нм) из тяжёлых различных металлов: хром, золото, палладий. Напыление производят в вакууме. Частички металла в виде паров оседают на возвышающихся участках поверхности исследуемого объекта.
2. Метод негативного контрастирования. На препарат наносят растворы, содержащие атомы тяжёлых металлов (фосфорно-вольфрамовая кислота). Осаждаясь около белковых частиц и заполняя все имеющиеся пространства, атомы тяжёлых металлов создают «окрашенный» фон, на котором
выявляются мельчайшие детали строения микроорганизмов.
После изготовления объекта изучения проводят электронную микроскопию. Увеличение электронного микроскопа составляет 50.000 раз, но отдельные структурные элементы можно увеличить до 300.000 раз. Также возможно получение увеличенного изображения на фотографии.
Контрольные вопросы.
1. Из каких основных частей состоит микроскоп?
2. Как правильно настроить свет в микроскопе?
3. В чём принцип фазово-контрастной микроскопии?
4. На чём основана темнопольная микроскопия и когда её используют?
5. На чём основана люминесцентная микроскопия?
6. Что такое электронный микроскоп и какова его разрешающая способность (увеличение)?
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №3
Тема: «Микроскопические методы исследования. Методы окрашивания препаратов»
Способы приготовления препаратов для микроскопии.
При помощи светового микроскопа можно изучать микроорганизмы, как в живом, так и в окрашенном виде. При исследовании микробов в живом состоянии можно получить представление о размере, форме и характере их движения. Иногда внутри живой клетки видны блестящие, сильно преломляющие свет гранулы и споры. Для изучения микробов в живом состоянии готовят препараты висячей и раздавленной капли.
Препарат висячей капли.
Для приготовления препарата висячей капли бактериологической петлёй в центр покровного стекла наносят небольшую каплю исследуемого материала, суспендированного в жидкости (изотонический раствор хлорида натрия – 0,9% NaCl). Затем берут специальное стекло с лункой в центре и края её смазывают вазелиновым маслом. Лункой предметного стекла накрывают каплю исследуемого материала на покровном стекле, так чтобы капля находилась в центре лунки. Слегка прижимают предметное стекло и быстро переворачивают. При правильном приготовлении препарата капля свисает в лунку. Вазелиновое масло предохраняет каплю от высыхания.
Препарат раздавленной капли.
Препарат готовят нанесением капли суспендированного в жидкости материала на предметное стекло, которое затем накрывают покровным.
Приготовление мазка.
Для изучения морфологии микроорганизмов, деталей их структуры используют метод окраски их анилиновыми красителями. Исследуемый материал разводят изотоническим раствором хлорида натрия (0,9% NaCl), маленькую каплю размазывают тонким слоем по предметному стеклу на площади диаметром 1 см и высушивают. Такой препарат называется мазком. Его фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии или метиловым либо этиловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.
Окраска микроорганизмов.
Для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование простого способа окраски бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания.