Рецепты приготовления сложных сред

Среды с углеводами.К основному бульону или расплавленному агару прибавляют нужное количество (0,1 —2%) определенного углевода например, глюкозид. После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, предпочтительнее 25—36% раствор углеводов, простерилизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением асептики к стерильным основным средам—после контроля стерильности среда готова к употреблению.

Среды с кровьюготовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических условиях (лучше в боксе) от 3 до 30% (обычно 5%) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45 °С. Определяют температуру среды, поднося сосуд к шее у угла нижней челюсти. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

Внимание! Среды с кровью растапливать нельзя—кровь изменит свои свойства.

Среды с сывороткой кровиготовят так же, как среды с кровью. К основным средам добавляют 10—20% сыворотки, не содержащей консерванта и предварительно инактивированной при 56 °С в течение 30 мин на водяной бане или в инактиваторе. При инактивации разрушается вещество (комплемент), губительно действующее на микробы.

Среды с желчью.К простым средам добавляют желчь в количестве 10—40% объема среды, устанавливают нужный рН и стерилизуют 20 мин при 120 "С. Можно стерильную желчь добавить к стерильной среде в асептических условиях.

Разлив агаровых сред в чашки Петри.Среды перед разливом расплавляют на водяной бане и остужают до 45—50 "С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15—20 мл среды (высота слоя 0,25—0,3 ем). Если слой выше, на нем менее контрастно выглядят олонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги (среда быстро высыхает) — ухудшаются условия культивирования. Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят крышкой вверх, Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на поверхности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки— пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде застыть. Если посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20— 30 мин. Если посев производят на следующий день после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в туже бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скошенного агара.Пробирки с 4—5 ил стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20 °) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 2\3 пробирки, иначе она может смочить пробку. После того как среда застынет, пробирки ставят вертикально—дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.

Внимание! Пользоваться средой, в которой нет конденсата, нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

 

Контрольные вопросы.

1. Каким требованиям должны удовлетворять питательные среды?

2. Как классифицируют среды по исходным компонентам?

3. Какие вещества служат для уплотнения сред?

4. Какие среды являются простыми или общеупотребительными и для чего их применяют?

5. Какие среды называют сложными, что служит их основой?

6. Какие среды позволяют получить преимущественный рост одних микробов при одновременном подавлении других?

7. На каких средах изучают ферментативную активность микробов?

 

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №5

Часть 1

МЕТОДЫ ПОСЕВОВ.

В зависимости от цели исследования, характера посевного материа­ла и среды используют разные методы посева. Все они включают обяза­тельную цель: оградить посев от посторонних микробов. Поэтому рабо­тать следует быстро, по без резких движений, усиливающих колебания воздуха. Во время посевов нельзя разговаривать. Посевы лучше делать в боксе.

Посев из пробирки в пробирку.Пробирку с посевным материалом

и пробирку со средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне, а их основания находились поверх кисти. Обычно пробирку с по­севным материалом держат ближе к себе. В правой руке, как писчее перо, держат бактериальную петлю, и стерилизуют ее, держа вертикально в пламени горелки. Мизинцем и краем ладони правой руки вынимают обе пробки одновременно. Извлекают пробки не рывком, а плавно - легкими винтовыми движениями. Вынув пробки, края пробирок обжигают в пламени горелки. Прокаленную петлю вводят через пламя [горелки в пробир­ку с посевным материалом, охлаждают и, набрав немного материала, ос­торожно переносят в пробирку со средой.

При посеве в жидкую среду посевной материал растирают на стенке пробирки над жидкостью и смывают средой.

При посеве на жидкие среды тампоном его погружают в среду и 3-5 секунд ополаскивают в ней. При посеве па плотную среду материал вти­рают в ее поверхность, вращая тампон, после чего тампон обеззаражива­ют (помещают в пробирку, в которой он был доставлен в лабораторию, и автоклавируют).

При посеве на скошенный агар материал обычно растирают на по­верхности среды зигзагообразными движениями снизу вверх, начиная от границы конденсата.

При посеве на плотные среды, разлитые в пробирки столбиком, петлёй с посевным материалом прокалывают столбик, производя так называемый посев «уколом».

После посева петлю извлекают из пробирки, края пробирки обжигают и, проведи пробки через пламя горелки, закрывают пробирки, после чего прокалывают петлю.

Посев жидкого материала можно производить стерильными пипетками (пастеровскими или градуированными). После посева пипетки погружают в дезинфицирующую жидкость. Посев во флаконы, матрацы и бутыли производят примерно так, как в пробирки, только сначала набирают материал (петлёй или в пипетку), а потом открывают сосуд со средой.

Сосуды с засеянной культурой надписывают и ставят в термостат.

Посев на пробирки с чашки Петри.

Изучив характер роста культуры на чашке, со стороны дна отмечают восковым карандашом нужный для посева участок. Чашку с посевным материалом ставят перед собой крышкой вверх. Левой рукой приоткрывают крышку и вводят под неё обожженную петлю. Остудив петлю, закрывают чашку и в левую руку берут пробирку со средой. Посев производят так же, как с пробирки в пробирку. После посева чашку переворачивают вверх дном.

Посев на агар в чашке Петри

Посев шпателем. Шпатель-это стеклянная или металлическая трубочка, конец которой загнут виде треугольника. Шпатель можно сделать из пастеровской пипетки, согнув под углом её тонкий конец, предварительно разогретой в пламени горелки.

Левой рукой слегка приоткрывают крышку, держа её большим и указательным пальцами. Петлёй, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность среды посевной материал, после чего тщательно втирают его круговыми движениями шпателя до тех пор, пока шпатель перестанет свободно скользить по поверхности среды, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно вращают чашку. По окончании посева шпатель вынимают из чашки и закрывают крышку. Стеклян­ной ниппель помещают в дезинфицирующий раствор, а металлический прокаливают и пламени горелки.

Посев петлей. Небольшое количество посевногоматериала (иногда его предварительно эмульгируют и стерильном изотоническом растворе или бульоне) втирают петлей и поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону. Затем у того места,где закончились штрихи, агар прокалывают истлей, снимая избыток посевного

материала. Оставшийся па петле посевной материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности среды, По окончании по­сева закрывают чашку и прожигают петлю.

Посев петлей на секторы. Чашку со стороны дна расчерчивают на секторы. 11осев производят зигзагообразными движениями от края чашкик центру. Необходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.

Посев тампоном. Тампон с посевным материалом вносят в слегка приоткрытую чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в

поверхность среды, вращая при этом тампон и чашку.

Посек газоном. Примерно 1 мл (20 капель) жидкой культуры (если культура с плотной среды, ее эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне) наносят на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности среды. Чашку слегка наклоняют и пи­петкой отсасывают избыток культуры, выливая ее в дезинфицирующий раствор. Туда же помещают пипетку.

Посев а толщу агара. Культуру, выращенную на жидкой среде, или эмульгированный материал вносят в сосуд с расплавленным, и остуженным до 450С шаром, перемешивают и выливают в стерильную чашкуПетри.Можно внести посевной материалов пустую чашку и залить 15-20 мл остуженного до 45оС агара. Для перемешивания содержимого чашки её слегка покачивают и вращают. Чашки оставляют на столе до застывания среды.

Засеянные чашки подписывают со стороны дна и помещают вверх дном в термостат.

 

Методы культивирования

Культивирование анаэробов сложнее, аэробов, так как их необходимо лишить доступа свободного кислорода. Для этого удаляют воздух из питательной среды различными способами.

Культивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и простейших. Культивирование этих микроорганизмов принципиально сходно с культивированием бактерий. Для них разработан специальные среды и подобранны режимы соответствующие их потребностям.

Культивирование риккетсий и вирусов. Риккетсии и вирусы являются облигатными паразитами, то есть могут развиваться только в живых клетках. Их культивируют в культурах тканей, организме экспериментальных животных, развивающихся куриных эмбрионах.

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №5

Часть 2

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

ИССЛЕДОВАНИЯ НА ПРИМЕРЕ СТАФИЛОКОККОВ

Кокки - это обширная группа микроорганизмов, включающая патогенных, условно-патогенных представителей. Общим признаком для всех патогенных кокков является их способность вызывать гнойные процессы. Все патогенные кокки неподвижны. Стафилококки имеют вид круглых шаров, размножаясь они образуют грозди винограда. Вырабатывают сахоролитические и протеолитические ферменты. Вырабатывают экзотоксин, энтеротоксин. К стафилококкам чувствительны скот, лошади, свиньи, куры. Пути передачи: контактно - бытовой, воздушно - капельный, воздушно - пылевой, пищевой. Проникают через кожу и слизистые.

Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.

Материал для исследования:

1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы) .

2. Слизь из зева (ангина)

3. Мокрота (пневмония)

4. Моча (цистит )

5. Дуоденальное содержимое (холецистит)

6. Кровь (подозрение на сепсис)

7. Рвотные мессы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые - токсикоинфекции или отравления)

8. Слизь из носа (обследование на бактеоносительство).

Основные методы исследования:

  1. Микроскопический
  2. Биологический
  3. Микробиологический

ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ:

ПЕРВЫЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: ,

Способы сбора исследуемого материала:

1. Гной из поражённых участков

Материал следует брать из глубоких слоев поражённого участка. При наличии открытых процессов гной берут стерильным тампоном, пастеровской пипеткой, платиновой петлёй, при закрытых абсцессах - стерильным шприцем.

2. Отделяемое слизистых оболочек носа, зева

Материал берут стерильным тампоном.

3. Мокрота

Собирают в стерильную посуду. :

4. Моча

Собирают в стерильную посуду (следует брать утреннюю мочу катетером)

5. Дуоденальное содержимое

В стерильные пробирки собирают порции А, В, С (можно в одну).

6. Кровь

10-15 мл. Берут стерильным шприцом или иглой из локтевой вены.

7. Рвотные массы

Собирают в стерильную посуду

8. Промывные водыжелудка.

Собирают в стерильную посуду

Все посевы ставят в термостат на сутки. Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса в осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.

Методы исследования:

1. Гной

Засевают на желточно - солевой агар и на агар с 3 - 5% кропи в чашках Петри. Параллельно из гноя делают мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопируют.

2. Отделяемое слизистых оболочек

Засевают на желточно - солевой агар и кровяной агар.

3.Моча

Центрифугируют, полученный осадок засевают на желточно - солевой и кровяной агар. Делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

4. Мокрота, дуоденальное содержимое

Засевают на желточно - солевой и кровяной агар.

5. Рвотные массы и пищевые продукты:

Предварительно растирают в ступке и эмульгируют в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида. 1 - 2 мл эмульсии засевают на желточно - солевой агар. Для получения изолированных колоний на чашки Петри исследуемый материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды.

Кровь засевают в сахарный бульон.

ВТОРОЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококков колонии, выросшие на желточно – солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой I культуры. При этом учитывают наличие лицетиназы, которое проявляется в образовании венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащем кровь. Колонии с чёткой зоной гемолиза (просветления) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови на сахарный бульоне инкубируют 10 суток, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно - солевую среду. При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.

ТРЕТИЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенном агаре культур делают мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопиют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшие изучение выделенной культуры:

1. ставят реакцию плазмокоагуляции

2. изучают гемолитические свойства

3. определяют продукцию ДНКазы

4. определяют ферментацию монната в анаэробных условиях

5. определяют устойчивость к антибиотикам

Реакция плазмокоагуляции.

Цитратную плазму, получаемую из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соответствии 1:4 и наливают в две преципитатные пробирки по 0,3 - 0,5 мл; В одну вносят петлю исследуемой культуры, другая служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37 С. Учет реакции производят через 2-3 часа. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре (24 С), после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свёртывается.

( не выливается из перевёрнутой пробирки).

В контрольной пробирке плазма не изменяет консистенции.

Определение гемолитических свойств:

Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие Альфа-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличий и на бараньей крови; продуцирующие Бетта-гемолизин лизируют только эритроциты барана).

Определение ДНКазы.

Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 часов на чашку с выросшими колониями стафилококков добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу он деполимерезуется ДНК и помутнение не образуется.

Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий ат«р с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18 - 24 часа при температуре 37 С. Положительная реакции характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).

ЧЕТВЁРТЫЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют.

Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококка, выделенного от разных больных и из объекта внешней среды. Для фаготипирования используют критические тест - разведения фагов. Это максимальное разведение фагов, при котором происходит лизис, соответствующего штамма стафилококка. В чашку Петри наливают 15% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30 - 40 минут. На 1 мл 4-6 часовой культуры выделенного стафилококка, распределённого на поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке.

Дно чашки делят на секторы или квадраты. Число секторов соответствует количеству фагов. Затем на каждый квадрат наносят 1 - ин фаг. Чашки ставят в термостат при температуре 37 С результаты определяют через 6-7 часов. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учёт производится через 18 - 24 часа. Полученную культуру стафилококков проверяют на чувствительность к антибиотикам. | Метод дисков

Взвесь полученной культуру высевают "газоном". В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или 1 взвесь микробов. Засеянные чашки подсушивают 30 - 40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянногоагара накладывают пинцетом бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки, одна чашка служит для изучения 1 - ого штамма к 4 - 5 антибиотикам. Засеянные чашки с нанесёнными на них дисками помещают в термостат при температуре 37 градусов на 18 - 24 часа. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной волы на поверхность посева. Учёт результатов:

Действие антибиотиков оценивают по феномену задержки роста вокруг диска. Диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью чувствительности и величиной зоны отсутствия роста есть зависимость. В ответе указывают чувствительность штамма. В ряде случаев определяют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам в наживном материале (гной и др.).

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

 

Схема выделения и идентификации стафилококка

 

Контрольные вопросы

1. Что входит в понятие «бактериологическое исследование»?

2. Какой должна быть культура для такого исследования?

3. Что такое колония микробов, культура, штамм, клон?

4. Что входит в понятие «культурные свойства микробов»?

5. Что означает фаготипирование?

6. Что означает идентификация микроорганизмов?

7. Каким способом определяется чувствительность микроорганизмов к антибиотикам?

8. Какие исследования проводятся на каждом из четырех этапов изучения возбудителя?

 

РАЗДЕЛ 2

ОСНОВЫ МЕДИЦИНСКОЙ

ВИРУСОЛОГИИ

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №6