Учтите и оцените результаты непрямой гемагглютинации (РНГА или РПГА).

Леч., пед ф-ты 2006

ЗАНЯТИЕ 10

 

Тема: Реакции иммунитета: реакция агглютинации, реакция преципитации.

Цель: Изучить реакции иммунитета: реакцию агглютинации (РА), реакцию преципитации (РП).

Знать:

1. Понятие иммунитет, его виды.

2. Антигены, их свойства; антигены микробной клетки.

3. Антитела, их свойства.

4. Сущность серологических реакций, их виды и практическое использование.

Уметь:

1. Поставить, учесть и оценить результаты РА на стекле, РА в развернутом ряду.

2. Учесть и оценить результаты РНГА.

3. Поставить, учесть и оценить реакцию кольцепреципитации по Асколи.

4. Учесть и оценить результаты РП в геле.

Контрольные вопросы:

1. Понятие иммунитет, его виды.

2. Антигены, их характеристика.

3. Антигены микробной клетки.

4. Антитела, классы иммуноглобулинов, их характеристика.

5. Понятие серологической реакции и ее практическое использование.

6. Реакция агглютинации и методы ее постановки.

7. Реакция преципитации, ее виды и практическое применение.

8. Получение агглютинирующих и преципитирующих сывороток и их применение.

9. Получение диагностикумов и их применение.

 

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Поставить, учесть и оценить результаты развернутой РА с сывороткой обследуемого с подозрением на брюшной тиф и брюшно-тифозным диагностикумом.

2. Поставить, учесть и оценить результаты РА на стекле с исследуемой культурой и агглютинирующей адсорбированной сывороткой Shigella sonnei.

3. Учесть и оценить результаты РНГА с сыворотками обследуемых с подозрением на бактерионосительство возбудителя брюшного тифа и Vi-эритроцитарным диагностикумом.

4. Поставить, учесть и оценить результаты реакции термокольцепреципитации Асколи с преципитирующей сибиреязвенной сывороткой и термоэкстрактом из кожи овец, поступающей на обрабатывающее предприятие из районов неблагополучных по сибирской язве.

5. Учесть и оценить результаты РП в геле с антитоксической противодифтерийной сывороткой и исследуемыми дифтерийными культурами.

6. Биопрепараты: диагностикумы; агглютинирующие и преципитирующие диагностические сыворотки.

 

Методические указания к выполнению практического занятия:

Поставьте, учтите и оцените результаты реакции агглютинации (РА) на стекле.

Постановка: на обезжиренное стекло нанесите каплю диагностической сыворотки и каплю физ. раствора для контроля. В каждую каплю внесите петлей суточную культуру микроорганизмов и тщательно перемешайте, чтобы капли были равномерно мутными.

Учет: реакция учитывается в течение 5 мин. невооруженным глазом или с помощью лупы.

Контроль антигена - КА — равномерное помутнение (исключается спонтанная агглютинация).

Опыт - РА - положительная: появление хлопьев, хорошо видимых при покачивании предметного стекла.

Опыт — РА - отрицательная: жидкость остается равномерно мутной.

Оценка результатов: отсутствие спонтанной агглютинации в КА в случае положительной реакции светельствует о соответствии антигенов исследуемой культуры антителам агглютинирующей сыворотки и принадлежности культуры к соответствующему роду, виду, серогруппе или серовару.

Поставьте, учтите и оцените результаты развернутой реакции агглютинации (РА).

Постановка: ее проводят по схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1

Схема постановки РА.

Ингредиенты Разведения сыворотки КА КС
1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600
 
 
 
Изотонический раствор, мл

1 1 --
Сыворотка обследуемого 1:50, мл -- -- -- -- -- 1 (1:50)
 
Диагностикум, капли

--

 

Примечание: стрелкой обозначен перенос разведенной сыворотки из пробирки

в дез. раствор
в пробирку.

 

Учет: инкубация PA осуществляется при 37° С в течении 2 ч, затем при комнатной t° 18-20 ч.

Реакцию учитывают невооруженным глазом до встряхивания пробирок, а затем при их легком встряхивании пальцем правой руки. В сомнительных случаях используют агглютиноскоп или лупу. Опытные пробирки сравниваются с контролями:

КА - равномерное помутнение, исключается спонтанная агглютинация антигена. КС — содержимое прозрачное, отсутствие спонтанной агглютинации антител. При таких контролях результаты РА, положительные или отрицательные, будут достоверными.

Интенсивность реакции выражается плюсами:

++++ - реакция резко положительная; весь агглютинат на дне пробирки в виде зонтика, жидкость над ним прозрачная;

+++ - реакция положительная; осадок выражен, надосадочная жидкость слегка мутная;

++ - частичная агглютинация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная;

+ - сомнительная агглютинация, жидкость мутная.

При отрицательной реакции — агглютинации нет, взвесь остается равномерно мутной и по виду неотличима от содержимого пробирки с контролем антигена. Титром РА считают максимальное разведение сыворотки с интенсивностью реакции не менее, чем ++.

Оценка результатов: для подтверждения или опровержения диагноза заболевания, полученный титр РА сопоставляют с диагностическим титром. Например: диагностический титр РА при брюшном тифе равен 1:100 у непривитых детей, 1:200 у непривитых взрослых.

Учтите и оцените результаты непрямой гемагглютинации (РНГА или РПГА).

Постановка: эритроциты, предварительно нагруженные (сенсибилизированные) антигеном или антителами – эритроцитарные диагностикумы вносят в лунки плексиглазовой панели, в которых приготовлены разведения сыворотки обследуемого или экстракты антигена.

Учет: результаты учитывают после часовой инкубации до 37° С. При отрицательном результате РНГА – эритроциты оседают в виде плотного диска; при положительном – оседают в виде зонтика с интенсивностью не меньше ++.

Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов:

КЭ – контроль несенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации;

КА – контроль сенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации;

КС – контроль сыворотки обследуемого с добавлением несенсибизированных эритроцитов на отсутствие в ней неспецифических факторов агглютинации.

Оценка результатов: сопоставляют титр РНГА с диагностическим титром. Например, в РНГА с сальмонеллезным Vi-диагностикумом он равен 1:40.

 

Таблица 2.

Схема постановки РНГА.

 

Ингредиенты Разведения сыворотки   КЭ КД
1:10 1:20 1:40 1:80
Физ. раствор (1-я пипетка)

1 1
Сыворотка обследуемого 1:5 (1-я пипетка) -- -- -- - -
3% взвесь эритроцитов (2-я пипетка) - - - - -
Эритроцитарный диагностикум (2-я пипетка)

-

 

 

в дез. раствор