Тема: Микробиологическая диагностика менингококковых и гонококковых инфекций.

Педиатрия

ЗАНЯТИЕ 16

Цель: На основе знаний биологии менингококков, гонококков и особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию вызываемых ими заболеваний.

Знать:

1. Особенности биологии менингококков и гонококков, определяющие их роль в инфекционной патологии человека.

2. Патогенез развития менингококковых и гонококковых инфекций.

3. Материал и методы микробиологической диагностики менингококковых и гонококковых инфекций.

4. Специфическую профилактику и терапию менингококковых, гонококковых инфекций.

Уметь:

1. Уметь микроскопировать препараты из СМЖ, уретрального гноя и интерпретировать полученные результаты.

2. Поставить, учесть и оценить результаты реакции латекс-агглютинации с менингококковой сывороткой и СМЖ.

3. Готовить фиксированные мазки из чистых культур, микроскопировать их и интерпретировать полученные результаты.

4. Учесть и оценить результат изучения биохимических свойств и определения антибиотикограммы исследуемых культур.

5. Определить видовую принадлежность исследуемых культур.

Контрольные вопросы:

1. Классификация и морфобиологические свойства менингококков, гонококков.

2. Факторы вирулентности менингококков и гонококков.

3. Экология, особенности эпидемиологии, патогенеза менингококковых и гонококковых инфекций.

4. Материал и методы микробиологичекой диагностики менингококковых, гонококковых инфекций.

5. Специфическая профилактика менингококковых инфекций.

6. Специфическая терапия гонококковых инфекций.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести исследование СМЖ больного с клиническим диагнозом «менингит»:

1.1. Промикроскопировать готовый препарат из осадка СМЖ, окрашенный метиленовой синькой, оценить полученный результат.

1.2. Поставить, учесть и оценить результаты реакции латекс-агглютинации со СМЖ и менингококковой сывороткой.

1.3. На основании полученных результатов дать заключение.

2. Провести бактериологическое исследование носоглоточного отделяемого с целью установления менингококкового носительства:

2.1. Ознакомиться с тампоном, используемым для забора слизи с задней стенки глотки (демонстрация).

2.2. Оценить результаты посева слизи с задней стенки глотки на сывороточный агар с ристомицином.

2.3. Приготовить препарат из агаровой культуры, выделенной от обследуемого, окрасить по Граму, промикроскопировать.

2.4. Учесть и оценить результаты посева исследуемой культуры на обычный питательный агар, 2 пробирки с сывороточным агаром (37°С, 22°С), «пестрый ряд».

2.5. Определить антибиотикограмму исследуемой культуры.

2.6. Полученные результаты занести в протокол и сделать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

3. Промикроскопировать препарат из уретрального гноя больного с подозрением на гонорею. Дать заключение.

4. Учесть и оценить результаты РСК с сывороткой больного с подозрением на хроническую гонорею. Дать заключение.

5. Ознакомиться и описать в протоколе биопрепараты: химическая менингококковая вакцина А+С, агглютинирующие менингококковые сыворотки, диагностические менингококковые сыворотки для латекс-агглютинации, гонококковая вакцина, гоноаллерген, указав, что они собой представляют, для чего и как применяются.

6. Контрольная работа: патогенные кокки.

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведите исследование СМЖ больного с клиническим диагнозом “менингит”, для чего:

· промикроскопируйте готовый препарат из осадка СМЖ, окрашенный метиленовой синькой, оцените полученный результат.

Одним из возбудителей гнойных менингитов являются менингококки. Для их выявления используют СМЖ, полученную путем люмбальной пункции. Желательно взять материал сразу при поступлении больного в стационар и до начала терапии.

Взятие СМЖ – врачебная манипуляция, осуществляемая с соблюдением правил асептики. Прозрачную СМЖ перед исследованием центрифугируют при 3500 об/мин в течение 5 мин и готовят мазки из осадка. Из мутной СМЖ мазки готовят без центрифугирования. Мазки окрашивают метиленовым синим и Граму. Обнаружение грамотрицательных диплококков бобовидной формы, обращенных вогнутой стороной друг к другу и находящихся в лейкоцитах, свидетельствет о менингококковой этиологии менингита.

· поставьте, учтите и оцените результаты латекс-агглютинации со СМЖ и менингококковой сывороткой.

Менингит – это тяжелое и быстро протекающее заболевание. Поэтому важно диагносцировать его в ранние сроки и быстро, чтобы начать своевременное этиотропное лечение. К числу таких методов, помимо РИФ с люминесцирующей иммунной сывороткой, относится латекс-агглютинация для обнаружения специфических полисахаридных антигенов N. meningitidis A, B, C, Y/W в СМЖ. При этом нужно иметь в виду, что микроскопия СМЖ не всегда позволяет обнаружить менингококки.

Для постановки реакции латекс-агглютинации СМЖ подогревают в течение 3 мин при 100°С и центрифугируют в течение 5 мин. По капле надосадочной жидкости и реагента, содержащего латексные частицы с моноклональными антителами к менингококкам, нанесите на …и смешайте с помощью специальной палочки. Параллельно поставьте реакцию с заведомо положительным контролем и реакцию с исследуемой СМЖ и латексными частицами с IgG не иммунизированного кролика.

Учет результатов осуществляется спустя 10 мин по феномену агглютинации, видимому невооруженным глазом. Положительная реакция - четкая агглютинация, в случае наличия агглютинации с заведомо положительным контролем и отсутствие реакции агглютинации с латексом с IgG не иммунизированного кролика, свидетельствует о наличии специфических антигенов N. meningitidis в СМЖ и указывает на его этиологическую роль в развитии менингита. Реакция не интерпретируется, если агглютинация прошла с латексом для негативного контроля. В этом случае нужно повторить тест с другой порцией СМЖ.

· Результаты микроскопического исследования и латекс-агглютинации занесите в протокол и сделайте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

II. Проведите бактериологическое исследование носоглоточного отделяемого с целью установления менингококкового носительства.

1 этап. В носоглотке менингококки могут быть обнаружены не только у больных, но и у носителей. Материал для исследования забирают натощак или не раньше, чем через 3-4 ч после еды, до начала антибиотикотерапии. Для этого используют специальный носоглоточный тампон, который на ¾ длины сгибают под углом 45°. Тампон заводят за мягкое небо и 2-3 раза проводят по задней стенке носоглотки, не касаясь языка, зубов, слизистой оболочки щек. Исследуемый материал засевают сразу или доставляют в лабораторию, не позднее 2-х ч, поместив тампон в пробирку таким образом, чтобы он не касался стенок. Исследуемый материал и посевы следует предохранять от охлаждения и высушивания, так как менингококк очень чувствителен к воздействию этих факторов. Поэтому для доставки используют специальную термосумку с грелками.

Посев методом «штрих с площадкой» осуществляется на чашки с питательным агаром, содержащим кровь, сыворотку или асцитическую жидкость. Параллельно используют данную среду с добавлением ристомицина, который задерживает размножение грамположительных кокков, содержащихся в отделяемом носоглотки. Посевы термостатируют при 37°С и повышенной концентрации углекислоты (5-10%) в течение 24-48 ч.

2 этап. Оцените результаты посева слизи с задней стенки глотки на сывороточный агар с ристомицином.

Менингококки образуют небольшие, круглые, прозрачные колонии, имеющие в проходящем свете голубоватый оттенок. Характерные изолированные колонии пересевают на сывороточный агар для получения чистой культуры и термостатируют при 37°С 18-24 ч.

3 этап.Приготовьте препарат из агаровой культуры, выделенной от обследуемого, окрасьте по Граму, промикроскопируйте.

Культуру идентифицируют по трем тестам, позволяющим отнести ее к роду Neisseria. Это характерная морфология (полиморфные дипло- и тетракокки), грамотрицательная окраска и положительная реакция на оксидазу. Для определения оксидазы изученную культуру наносят на специальные диски. Если сразу происходит красно-фиолетовое окрашивание, то культура оксидазоположительная. Для видовой идентификации и дифференциации от непатогенных нейссерий, постоянно обитающих в верхних дыхательных путях используют комплекс свойств (таблица 1).

Таблица 1.

Дифференцированные свойства некоторых видов рода Neisseria

№ пп	Свойства	N. meningitidis	N. gonorrhoeae	N. subflava	N. mucosa	N. sicca
1.	Оксидаза	+	+	+	+	+
2.	Каталаза	+	+	+	+	+
3.	Пигмент	-	-	+	d	d
4.	Рост при 22°	-	-	+	+	+
5.	Потребность для роста в крови или сыворотке	+	+	-	-	-
6.	Образование кислоты при расщеплении: - глюкозы - лактозы - мальтозы - сахарозы - фруктозы	+ - + - -	+ - - - -	+ - + d d	+ - + + +	+ - + + +

Обозначения: “+” – 90% и более штаммов положительные;

“-“ – 90% и более штаммов отрицательные;

d – 11-89% штаммов положительные.

Определение антибиотикограммы менингококков осуществляется диско-диффузионным методом (ДДМ).

4этап. Учтите и оцените результаты посева исследуемой культуры на обычный питательный агар, 2 пробирки с сывороточным агаром (37°С, 22°С), «пестрый ряд».

У идентифицированных культур менингококков определяют серогруппу в РА с типоспецифическими сыворотками (А, В, С, D, 29E, 135W, X, Y, Z).

На основании полученных результатов, которые внесите в протокол, определите видовую принадлежность культуры, ее чувствительность к антибиотикам и сделайте вывод; заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

III. Промикроскопируйте окрашенный по Граму препарат из уретрального гноя больного с подозрением на гонорею. Дайте заключение.

При положительном результате в препарате обнаруживают гонококки – грамотрицательные диплококки бобовидной формы находящиеся внутри лейкоцитов. Эта микроскопическая картина наблюдается при острой гонорее до применения антибиотиков. При хронической гонорее бактериоскопическое исследование дает отрицательный результат так как гонококки имеют атипичную форму, вариабельны в окраске по Граму и в препарате обнаруживают разнообразную постороннюю микрофлору.

IV. Учтите и оцените результаты РСК с сывороткой больного с подозрением на хроническую гонорею. Полученные результаты занесите в протокол и сделайте заключение (см. занятие № 11).

V. Ознакомьтесь и опишите в протоколе бак. препараты: химическая менингококковая вакцина А+С, агглютинирующие менингококковые сыворотки, диагностические менингококковые сыворотки для латекс-агглютинации, гонококковая вакцина, гоноаллерген, указав, что они содержат, для чего и как применяются.

Вопросы для самоконтроля:

1. Правила забора и доставки отделяемого с задней стенки носоглотки с целью диагностики менингококкового назофарингита и носительства.

2. Обоснуйте возможность использования микроскопического метода диагностики при менингококковых инфекциях.

3. Обоснуйте необходимость знания патогенеза менингококковой инфекции для обоснованного выбора материала для микробиологической диагностики.

4. Обоснуйте выбор методов микробиологической диагностики при менингококковом назофарингите, менингококкемии и эпидемическом менингококковом менингите.

5. С какой целью проводится серотипирование выделенного возбудителя при менигококковых и гонококковых инфекциях?

6. Назовите метод микробиологической диагностики менигококковых и гонококковых инфекций, позволяющий уточнить выбор препаратов для этиотропной терапии.

7. Назовите методы экспресс-диагностики менингококковых инфекций, в чем их сущность?

8. Назовите отличительные признаки патогенных нейссерий от непатогенных.

9. Какого типа вакцины используют для специфической профилактики менингококковых инфекций, тактика их применения.

10. Назовите особенности микробиологической диагностики острой и хронической гонореи, обоснуйте выбор методов.

11. Назначение гоновакцины.

12. Назначение провокаций (биологическая, физиологическая, алиментарная и др.) при гонококковых инфекциях.

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 370-376.

2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 332-341.

Лекции по микробиологии.

Тесты.