Разрешающая способность иммерсионного микроскопа – 0,2-0,4 мкм.
4. Освоение техники иммерсионной микроскопии(микроскопия демонстрационного препарата Saccharomyces cerevisiae,окраска раствором метиленового синего). В поле зрения микроскопа наблюдаются овальные, круглые, вытянутые синего цвета клетки гриба, расположенные беспорядочно и неправильными скоплениями. Препарат зарисовать.
Освоение техники приготовления мазка из агаровой культуры бактерий и окраски его простым способом.
Этапы приготовления мазка:
1. Препараты для микроскопического исследования готовят на чистых предметных стеклах, обезжиривая их поверхность мылом с последующим его удалением сухой негигроскопичной ватой. Наносят на обезжиренную поверхность стекла каплю водопроводной воды (на хорошо обезжиренном стекле капля растекается).
2. Бактериальную петлю, изготовленную из платиновой, нихромовой или никелиновой проволоки стерилизуют прокаливанием докрасна в пламени горелки, держа ее в пламени сначала вертикально, а затем горизонтально, после чего обжигают примыкающую к петле часть держателя. Стерильную петлю используют для взятия микробной массы, держа ее в правой руке, как карандаш. Пробирку или колбу с питательной средой берут в левую руку так, чтобы поверхность с ростом культуры была обращена вверх, вынимают пробку из сосуда мизинцем правой руки, прижимая ее к ладони. Края сосуда обжигают в пламени горелки, вводят в него прокаленную петлю, прикасаясь ею к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от роста микроорганизмов, с целью охлаждения петли. Захватывают небольшое количество микробной массы, равномерно распределяя ее в капле воды в виде кружка или овала диаметром около 1 см. Если микроорганизмы выращены на жидкой питательной среде, культуру наносят на стекло петлей или стерильной пипеткой. Пипетку дезинфицируют 3—5% раствором фенола, остатки культуры на петле сжигают в пламени горелки и ставят петлю вертикально в штатив или специальный стакан. Тонкий и равномерный по толщине препарат можно получить, используя методику приготовления мазка крови. Для этого к капле жидкости или крови, нанесенной к концу стекла, подводят край шлифованного стекла под углом в 45°, капля растекается по краю этого стекла, после чего делают мазок быстрым движением шлифованного стекла. Мазок высушивают на воздухе.
3. Высушенный мазок в целях умерщвления микробных клеток и прикрепления их к стеклу фиксируют. Обычно применяют физический метод - фиксацию мазка над пламенем горелки или спиртовки троекратно (по 1 сек) мазком вверх. Правильно зафиксированный препарат, приложенный к тыльной стороне кисти, вызывает чувство выраженного тепла, но не жжения. Ни в коем случае стекло не следует перегревать и не подвергать фиксации влажный мазок. Это приводит к деформации и резкому уменьшению размеров и без того мелкого объекта исследования. Химический метод фиксации более щадящий. Используют этанол (10—15 мин), ацетон (5 мин), смесь Никифорова (смесь равных объемов этанола и эфира—10— 15 мин), метанол (3 мин), пары осмиевой кислоты, формалин (несколько секунд).
4. Окраска препарата простым способом: на мазок при помощи пипетки наносят 2-3 капли растворов водного фуксина (1-2 мин.), метиленового синего (3-5 мин.) или иного красителя. По окончании окрашивания мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Среди сложных методов окраски микроорганизмов широкое распространение получил метод Грама (обычно в модификации Синева), имеющий большое дифференциально-диагностическое значение в бактериологии.
Техника окраски по Граму.
· карболовый генциан-виолет – 1 - 2 мин. (на полоски фильтровальной бумаги, пропитанные раствором генциан-виолета и высушенные, наносят несколько капель воды);
· краску сливают, не промывая водой, наносят раствор Люголя на 1 мин. При этом мазок чернеет;
· раствор Люголя сливают, обрабатывают препарат спиртом в течение 30 сек., слегка покачивая мазок (до прекращения отхождения лиловых струек);
· немедленно промывают мазок водой;
· докрашивают препарат водным фуксином в течение 1 - 2 мин;
· мазок промывают, высушивают, микроскопируют.
Способность бактерий различно окрашиваться по методу Грама, обусловлена различиями структуры и химического состава бактериальной клетки, прежде всего, оболочки. В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы — грамположительные и грамотрицательные.
Грамположительные (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus и др.) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, т.к. их оболочечные структуры связывают и прочно удерживают комплекс генциан-виолета с йодом, не обесцвечивающийся спиртом. Грамотрицательные бактерии (Escherichia coli) окрашиваются в светло-красный цвет, поскольку их оболочка неспособна формировать и удерживать комплекс генциан-виолета с йодом, легко обесцвечиваясь спиртом.
При окраске бактерий по методу Грама необходимо учитывать следующие обстоятельства:
· возраст культуры имеет существенное значение, так как в "старых" культурах тинкториальные свойства бактерий могут быть изменены;
· мазок должен быть тонким и равномерным;
· не рекомендуется подвергать препарат форсированной горячей сушке;
· окрашивать можно лишь полностью остывший препарат.
Изучение морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов в препаратах, приготовленных из материала от больного, лежит в основе бактериоскопического метода исследования. Этот метод широко используется в диагностике чумы, туберкулеза, гонореи, сифилиса и ряда других заболеваний.
7. Ознакомление с морфологией и тинкториальными свойствами (отношение к окраске по Граму) различных видов бактерий (микроскопия демонстрационных препаратов). Промикроскопировать, описать и зарисовать следующие микропрепараты;
1. Стрептококки (Streptococcus pyogenes) - рис. 1. Грамположительные шаровидные микробы, располагающиеся в виде цепочек.
2. Стафилококки (Staphylococcus aureus) – рис. 2. Грамположительные шаровидные микробы, располагающиеся в виде гроздьев винограда.
3. Кишечная палочка. (Esherichia coli) – рис. 3. Грамотрицательные палочковидные бактерии с закругленными концами, расположенные беспорядочно.
4. Вибрионы холеры (Vibrio cholerae) – рис.4. Грамотрицательные бактерии в виде запятых.
5. Стрептобациллы (Bacillus cereus) - рис. 5. Окрашиваются по Граму положительно, имеют форму палочек, концы которых обрублены. Образуют цепочки, в теле микробной клетки могут быть видны неокрашенные участки спор. По морфологии напоминают возбудитель сибирской язвы. Препараты описать и зарисовать.
По окончании работы пробирки с культурами и демонстрационные мазки сдаются дежурным группы и возвращаются на лаборантский стол. Микроскопы ставят в нерабочее положение и сдают лаборанту кафедры. Воду из тазиков выливают вбак, рабочий стол протирают дезинфицирующим раствором. В конце занятия проводится дезинфекция и мытье рук. Тетрадь с записями и зарисовками, сделанными в ходе занятия, представляется преподавателю на подпись.
8. Знакомство с бактериоскопическим методом диагностики инфекционных болезней. Бактериоскопический метод основан на изучении морфологических и тинкториальных особенностей бактерий в препаратах, приготовленных из материала от больного. Метод широко используется в диагностике чумы, туберкулеза, гонореи, сифилиса и ряда других заболеваний.
Педиатрические аспекты
Значение медицинской микробиологии в практической деятельности врача-педиатра.