Структура бактериальной клетки.
Бактериальная клетка состоит из оболочки или клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы с нуклеоидом и включениями (рис. 12 – см. приложение). У отдельных видов бактерий имеются жгутики (органы движения), пили (реснички, фимбрии), капсулы, споры.
Оболочка обеспечивает форму бактерии, защищает ее от неблагоприятных внешних воздействий и высокого внутреннего осмотического давления. Она имеет многослойную структуру и сложный химический состав, отличающийся у грамположительных и грамотрицательных бактерий. В состав оболочек всех бактерий входит ригидный слой (пептидогликан), в состав которого входят уникальные вещества, не обнаруженные у других видов живых существ – D (правовращающие) аминокислоты, диаминопимелиновая кислота. У грамположительных бактерий клеточная стенка содержит особые тейхоевые кислоты, она толще и содержит меньше липидов, чем у грамотрицательных бактерий. Оболочка грамотрицательных бактерий содержит полипептидные и полисахаридные слои. Снаружи клеточной стенки расположен слизистый слой, который у ряда бактерий может набухать, увеличиваясь в размерах, образуя капсулу. Капсула состоит из полисахаридов, реже – из полипептидов, обладает малым сродством к красителям, поэтому для ее выявления применяют негативные методы окраски, например, метод Гинса-Бурри. У некоторых патогенных бактерий (пневмококк, сибиреязвенная палочка) капсула образуется исключительно в организме животного или человека, тогда как у других видов бактерий (клебсиеллы) капсулообразование наблюдается при культивировании на питательных средах. Капсула защищает бактерию от действия неблагоприятных воздействий внешней среды и факторов иммунитета. Имеются непатогенные виды бактерий, которые при размножении в растворе сахара образуют капсулы, при этом растворы приобретают слизистую консистенцию.
Цитоплазма бактерий может быть гомогенной, равномерно окрашивающейся, или содержать разнообразные включения органической и минеральной природы (включения волютина, фосфатов, серы, липидов и т.д.), выполняющие функции резервных веществ. Зерна волютина являются запасными питательными веществами и для некоторых видов бактерий (дифтерийная палочка) могут быть дифференциально-диагностическим признаком. Для выявления зерен волютина применяют специальный метод окраски по Нейссеру. Цитоплазма прокариотов покрыта цитоплазматической мембраной – аналогом митохондрий эукариотов, играющей жизненно важную роль в обменных (окислительно- восстановительных) реакциях у бактерий
При электронной микроскопии срезов бактериальной клетки в цитоплазме отчетливо видны нуклеоид (аналог ядра эукариотов), рибосомы и мезосомы – выпячивания внутреннего слоя цитоплазматической мембраны. Мезосомы принимают участие в делении бактерий и создании их оболочки.
Величина бактерий измеряется в микрометрах. Большинство кокков имеют диаметр около 0,5—1 мкм, у палочковидных форм поперечный размер составляет 0,5— 2 мкм, а длина варьирует в широких пределах. Длинные формы (до 500 мкм) могут наблюдаться среди спирохет.
Некоторые виды палочковидных бактерий в неблагоприятных условиях существования образуют споры. Спорообразующие палочковидные бактерии называют бациллами или клостридиями, а неспорообразующие - бактериями. Из патогенных бактерий спорообразующими являются сибиреязвенная палочка, возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма. Спорообразование обеспечивает сохранение вида в неблагоприятных условиях. Спора по своей устойчивости к различным факторам внешней среды значительно превосходит вегетативную форму, из которой она образовалась. От вегетативной формы спора отличается меньшим содержанием воды и плотной, многослойной оболочкой, содержащей липиды, а также наличием особого вещества – дипиколината кальция, что обеспечивает высокую устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов, в том числе, высыханию, повышенной или пониженной температуре и проч. в течение длительного промежутка времени. Процесс спорообразования заканчивается отмиранием и лизисом вегетативной формы. Попадая в благоприятные условия, спора быстро прорастает, вновь превращаясь в вегетативную форму. Спора, образующаяся внутри цитоплазмы бактериальной клетки, может иметь круглую или овальную форму, располагаясь в центре (центрально), на конце (терминально) или ближе к одному из концов (субтерминально) (рис. 13). Форма, величина и расположение споры являются характерной особенностью вида бактерий.
| 
| 
|
| Рис.13. Центральное (а), субтерминальное (б) и терминальное расположение спор (в) |
Сложные методы окраски
Применяются для выявления некоторых структурных элементов микробной клетки, для окраски бактерий, не поддающихся окраске простыми методами, для дифференциально-диагностических целей. Наиболее часто, помимо окраски по Граму, применяются методы Циля-Нильсена, Гинса-Бурри, Нейссера, Ауески, Романовского-Гимзы.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена.Бактерии, содержащие большое количество липидов, например, микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), не окрашиваются простыми методами. Для их окраски применяют концентрированные спиртовые растворы красителей, содержащие протравы (фенол), проводя окрашивание при подогревании.
Методика окраски:
· на фиксированный мазок накладывают соответствующего формата листок фильтровальной бумаги, на которую наносят несколько капель карболового фуксина Циля;
· препарат нагревают над пламенем спиртовки 2-3 раза до появления паров, наблюдая сбоку, на уровне предметного стекла;
· препарату дают остыть, удаляют бумажку с фуксином, промывают мазок водой;
· обесцвечивают препарат 3% соляно-кислым спиртом до прекращения отхождения красных струек, промывают водой;
· докрашивают в течение 3-5 мин. раствором метиленового синего. Препарат промывают, высушивают, микроскопируют. Кислотоустойчивые туберкулезные микобактерии при микроскопии рубиново-красные, тонкие, но могут быть изогнутыми, ветвящимися, зернистыми. Другие элементы мокроты окрашиваются в синий цвет.
Окраска спор по методу Ауески.В связи с многослойной структурой и особенностями химического состава споры они не окрашиваются обычными методами. Поэтому, как и при окраске по методу Циля-Нильсена, применяют концентрированный карболовый фуксин Циля. Окраска модифицированным методом Ауески выполняется по методу Циля-Нильсена, однако обесцвечивание проводится 0,5% HCl. Необходимо избегать грубой фиксации мазка над пламенем. Вегетативные клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, споры - в ярко-малиновый.
Негативный метод Бури.Каплю культуры или другого материала (например, зубной налет для обнаружения спирохет) смешивают с каплей туши и из этой смеси делают препарат по типу мазка крови.
Выявление капсул по методу Гинса уKlebsiella pneumonae. Капсула не выявляется при окрашивании обычными методами, так как входящие в ее состав слизистые вещества полисахаридной природы, окрашиваются плохо или не окрашиваются совсем. Для выявления капсул (например, у пневмококка - Streptococcus pneumoniae) можно использовать простые или сложные (по Граму, Гинсу-Бурри) методы окраски, при этом в мазке, окрашенном простыми методами, на фоне окрашенной ткани органа видны мелкие неокрашенные капсулы, внутри которых попарно (диплококки) или одиночно располагаются грамположительные ланцетовидные пневмококки. Методика окраски капсул по методу Гинса-Бурри заключается в следующем:
· на предметное стекло наносят каплю жидкой натуральной туши и небольшую каплю воды, в которой эмульгируют исследуемую культуру;
· уголком шлифованного стекла обе капли перемешивают и по поверхности предметного стекла плоскостью шлифованного угла делают мазок. После подсушивания мазок осторожно фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают в течение 1-2 мин. разбавленным 1:3 фуксином Циля, высушивают и микроскопируют. При микроскопии фон препарата темно-бурый, клетки бактерий красные. Капсулы выглядят в виде бесцветных овалов вокруг красных клеток бактерий (рис. 7).
Окраска зерен волютина по методу Нейссера. Зерна волютина, являющиеся важным дифференциально-диагностическим признаком дифтерийной палочки (Corynebacterium diphtheriae) обладают метахромазией, т.е. окрашиваются некоторыми красителями иначе, чем цитоплазма клетки, и поэтому могут быть легко выявлены при применении специальных методов окраски.
Методика окраски:
· фиксированный мазок окрашивают в течение 2-3 мин раствором уксусно-кислого метиленового синего Нейссера, после чего промывают водой;
· обрабатывают раствором Люголя в течение 20-30 сек.;
· не промывая водой, препарат окрашивают раствором везувина в течение 10-15 сек.;
· мазок промывают, высушивают, микроскопируют. Клетки коринебактерий окрашены везувином в золотисто-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-коричневый, почти черный.
Окраска риккетсий по методу Здородовскогопредставляет собой модифицированный метод Циля—Нильсена. Для этого 10-15 капель карболового фуксина Циля разводят в 10 мл дистиллированной воды, препарат окрашивают 5 мин, обесцвечивают его 0,01% раствором соляной кислоты в течение 1—3 сек., промывают водой и докрашивают 1% раствором метиленового синего. Риккетсии, содержащие высокое содержание липидов, сохраняют окраску фуксином, в то время как клетки, в которых паразитируют риккетсии, обесцвечиваются кислотой, окрашиваясь в синий цвет.
Окраска по методу Романовского-Гимзы. Краситель Романовского-Гимзы состоит из азура (продукта окисления метиленового синего и эозина). Краситель перед употреблением разводят нейтральной дистиллированной водой из расчета одна капля красителя на 10 мл дистиллированной воды. Краситель наносят на препарат, предварительно фиксированный жидким фиксатором (обычно смесью Никифорова), на 1 ч, после чего препарат промывают водой и высушивают. При микроскопии ядра клеток красно-фиолетового цвета, цитоплазма – голубого. Метод Романовского-Гимзы используется для окраски спирохет, простейших, риккетсий. Спирохеты, в зависимости от их химического состава (содержания нуклеопротеидов), окрашиваются в сине-фиолетовый (боррелии, лептоспиры) или розовый цвет (трепонемы).