Фагоцитоз с культурой стафилококка
Реактивы - пирогенал (стимулятор фагоцитоза), гепарин, суточная культура стафилококка, краситель Романовского-Гимзе. Этапы опыта:
1. Кровь из пальца 0,2 мл помещают в первую пробирку с гепарином и во вторую пробирку, куда добавляют 0,1 мл пирогенала для стимуляции фагоцитоза (стимулированный фагоцитоз - ФС). В каждую из пробирок добавляют суточную культуру стафилококка в объеме 0,05 мл (стандарт мутности -1 млрд).
2. Инкубируют пробирки в термостате 30 мин, центрифугируют, отбирают надосадочную жидкость.
3. Из осадка делают мазок, высушивают, фиксируют этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимзе.
4. Учет результатов при иммерсионной микроскопии (увеличение 630).
1 пробирка:
Спонтанный фагоцитоз - учет результатов через 30 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс.
Завершенный фагоцитоз-учет результатов через 120 мин. Определяется фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс.
Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) определяется как отношение фагоцитарного индекса 30 мин к фагоцитарному индексу120 мин (ИЗФ= ФИ 30 мин/ФИ 120 мин )
Если ИЗФ более 1, то это указывает на завершенный характер фагоцитоза.
Если ИЗФ менее 1, это указывает на незавершенный характер фагоцитоза.
2 пробирка:
Стимулированный фагоцитоз (в присутствии пирогенала). После инкубации и центрифугирования из осадка готовят мазки, которые высушивают, фиксируют и окрашивают аналогичным способом. В мазках подсчитывают фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс и индекс завершенности фагоцитоза через 120 мин.
Стимуляция пирогеналом может привести к завершенности фагоцитоза. Эти данные необходимо учитывать при коррекции иммунодефицитных состояний.
Изучение функционального состояния фагоцитов по кислородному метаболизму (метод хемилюминесценценции)
1. Из периферической крови выделяют взвесь лейкоцитов (нейтрофилов).
2. Во флаконы для сцинтилляционного счета добавляют раствор Хенкса и люминол (люминол обладает свойством окисляться под влиянием кислородных метаболитов и генерировать квант света (длина волны 425 пт).
3. Во флаконы вносят суспензию нейтрофилов, перемешивают и помещают в счетную камеру для регистрации фонового показателя хеми-люминесценции.
4. Через 45 - 60 мин во флаконы вносят суспензию зимозана или латекса и снова измеряют хемилюминесценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 60 мин. Далее делают пересчет импульсов на 1 клетку и выражают хемилюминесценцию условно в импульс/минута/ клетка. Результат хемилюминесценции оценивается по максимальному значению (пик А) на кинетической кривой.
Для постановки опыта нужен жидкостный сцинтилляционный -спектрометр (хемилюминометр) и специальные стеклянные флаконы для сцинтилляционного счета.
ДЕМОНСТРАЦИЯ
1. Гемолитическая активность стафилококков на кровяном агаре.
2. Лецитиназная активность стафилакокков на ЖСА.
3. Реакция плазмокоагуляции.
4. ДНК-азная активность микробов.
5. Реакция титрования лизоцима слюны с тест - микробом Micrococcus lysodeikticus
6. Мазки гноя с незавершенным фагоцитозом (от больных острой гонореей).
7. Мазки из культуры Klebsiella pneumaniae с капсулой (окраска по Бури - Гинсу).
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Освоение методов экспериментального заражения животных.
2. Приготовить мазки-отпечатки из органов мышей, окрасить их по Граму промикроскопировать, обнаружить в мазках-отпечатках возбудителя, сделать выводы.
4. Изучить по готовым демонстрациям факторы патогенности микробов.
5. Микроскопия готовых мазков с фагоцитозом латекса.
6. Микроскопия мазков гноя от больных с гонореей.
7. Определение титра лизоцима в слюне в реакции титрования.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Понятие "инфекция", "инфекционное заболевание". Условия возникновения. Формы проявления: местная, генерализованная инфекция.
2. Что такое рецидив, реинфекция, суперинфекция?
3. Что такое смешанная инфекция, вторичная инфекция?
4. Что такое бактериемия, септицемия, септикопиемия, токсинемия?
5. Что такое бактерионосительство?
6. Понятие "патогенность" и "вирулентность". Единица измерения вирулентности, методы определения.
7. Периоды динамики инфекционного процесса.
8. Токсины микробов. Экзо - и эндотоксины, их природа, характеристика, отличия.
9. Факторы патогенности у микробов: инвазивность, ее материальная основа; адгезия. Защита от фагоцитоза.
10. Экспериментальная инфекция: цели и задачи, способы заражения животных.
11. Защитные механизмы и факторы естественной резистентности: барьерные и бактерицидные свойства кожи, слизистых оболочек, значение нормальной микрофлоры.
12. Лизоцим, комплемент, свойства, роль в естественной резистентности.
13. Бактерицидность сыворотки крови и факторы ее обеспечивающие:
В-лизины, система пропердина, нормальные антитела.
14. Фагоцитоз как клеточный неспецифический защитный фактор. Виды фагоцитов, стадии фагоцитоза. Незавершенный фагоцитоз.
15. Постановка опыта фагоцитоза, определение активности и завершенности реакции. Опсоно - фагоцитарная реакция.
16. Вскрытие и бактериологическое исследование трупа животного,
погибшего от экспериментальной инфекции.
17. Реактивность новорожденных и детей первых месяцев жизни, отличие от реактивности взрослых.
18. Состояние факторов естественной резистентности у детей раннего возраста.
ЗАНЯТИЕ №12 (КОЛЛОКВИУМ)
Темы: