Технология получения ферментных препаратов из культур микроорганизмов.

Технологический процесс получения микробных ферментных препаратов включает три этапа:

- получение посевной культуры продуцента;

- производственное культивирование продуцента глубинным или поверхностным способом при параметрах, обеспечивающих максимальный выход целевого продукта или продуктов ферментации;

- получение технических или очищенных ферментных препаратов из культур микроорганизмов или культуральной жидкости.

Получение посевного материала. Технологическая схема получения посевной культуры продуцента во многом зависит от способа производственной ферментации.

При производстве ферментных препаратов на основе поверхностного культивирования продуцентов в основном используют культуры микроскопических грибов. Посевной материал может в данном случае может быть приготовлен двух видов (Грачева И.М., рис. 1.1; 1.2; 1.3):

1) культура, выращенная на твердой питательной среде с титром спор не менее 7*10⁸ в 1 г;

2) мицелиальная масса продуцента, выращенная глубинным способом на жидкой питательной среде.

Независимо от вида посевного материала, технологический процесс включает следующие этапы:

- приготовление питательной среды;

- стерилизация среды, оборудования и коммуникаций;

- охлаждение среды в кюветах или биореакторе до температуры инокуляции;

- засев среды исходным штаммом продуцента;

- выращивание культуры до определенного возраста;

- консервирование посевного материала.

Для производственного культивирования продуцентов глубинным способом посевной материал также готовят глубинным способом для грибов и актиномицетов в виде мицелиальной массы, для бактерий – в виде молодой спороносной культуры (Грачева И.М., рис. 1.4). При этом соблюдается следующая последовательность операций:

- активизация исходной культуры на агаризованной среде;

- выращивание культуры жидкой среде в колбах на качалке;

- культивирование продуцента в малом и, если необходимо, в большом инокуляторе.

Посевная доза продуцента для производственной ферментации может варьироваться в широких пределах (1-15%). Исходя из этого, количество стадий инокуляции определяется производительностью предприятия и оптимальной посевной дозой продуцента.

Для производственного культивирования микроскопических грибов в асептических условиях достаточной является доза внесения спорового материала 0,02-0,05%, при культивировании в неасептических условиях – 0,2-1,0% от массы питательной среды. При использовании мицелиальной массы посевную дозу увеличивают до 1,5-2,5%. При глубинном культивировании продуцентов посевную дозу устанавливают: для спорового материала 0,2-1,0%, для мицелиальной массы микромицетов и для дрожжевых культур – 1,0-2,5%; для культур актиномицетов и бактерий – 5-6%, а в отдельных случаях – до 15-20%.

Производственное культивирование продуцента. Данный этап технологического процесса включает основные операции, характерные для большинства биотехнологических производств:

- приемка и подготовка сырья;

- приготовление синтетических или комбинированных питательных сред;

- стерилизация питательных сред, растворов, аппаратуры;

- установление оптимальных для синтеза целевого продукта значений температуры, рН среды, интенсивности аэрации;

- инокуляция культуры продуцента и производственная ферментация.

При подборе питательных сред основными требованиями являются полноценность состава среды для роста продуцента и синтеза целевого продукта; дешевизна и доступность сырья, используемого в качестве источников углерода, азота и минеральных веществ; потребность культивируемых микроорганизмов в специфических индукторах синтеза того или иного фермента.

Особенности состава питательных сред для поверхностного культивирования.

При поверхностном культивировании микромицетов на твердых средах основой большинства производственных питательных сред являются пшеничные отруби, имеющие следующий состав (%): крахмал – 16-20; белок - 10-12%, жир – 3-4; клетчатка – 30-40; зола – 2,5-3. Отруби являются дорогостоящим сырьем, поэтому их частично заменяют компонентами выполняющими функции разрыхлителей (например, древесные опилки) или обогатителей питательной среды (солодовые ростки, лузга крупяных культур, свекловичный жом, картофельная мезга, выжимки плодов и ягод).

В качестве основы питательной среды может быть использован нерастворимый остаток культуры после экстракции ферментов (биошрот) при условии его обогащения крахмалом и другими ростовыми веществами.

Среды для поверхностного культивирования стандартизуют по содержанию крахмала (16 – 20 %).

Особенности состава питательных сред для глубинного культивирования.

При составлении питательных сред для глубинного культивирования продуцентов в качестве основы используют гидролизаты растительного сырья, спиртовую барду, свеклосахарную мелассу и гидрол (разбавленные до оптимального для роста продуцента содержания растворимых веществ), молочную сыворотку. В состав питательных сред могут вводиться малорастоворимые источники углерода и других питательных веществ, однако их высокое содержание приводит к повышению вязкости среды, что в свою очередь, затрудняет диффузию растворенных веществ и кислорода, снижает разделяемость системы по завершении ферментации.

В качестве источника углерода в состав жидких питательных сред могут вводиться вещества липидной природы (жирные кислоты, фосфолипиды и др.), в первую очередь, в процессах биосинтеза липаз.

В качестве источников азота используются нитраты калия и натрия; соли аммония (фосфаты различной степени замещения, нитраты, хлориды, сульфаты, цитрат двухзамещенный) и аммиачная вода; мочевина; аминокислоты и пептиды. Дополнительно в качестве источников фосфора в состав сред могут вводиться фосфаты калия и натрия различной степени замещения. Ряд продуцентов требуют наличия в составе питательной среды комплекса витаминов группы В (биотина, инозита, пантотеновой кислоты, тиамина, пиридоксина).

В качестве обогатителей питательных сред в ферментных производствах используют кукурузный экстракт, соевую и кукурузную муку, дрожжевые гидролизаты и автолизаты.

Содержание сухих веществ питательной среды в зависимости от вида продуцента и биохимических особенностей синтеза целевого продукта варьируется в пределах от 2,5 до 20%.

Примеры производственного культивирования продуцентов ферментных препаратов глубинным и поверхностным способами представлены в таблицах 2 и 3 (аппаратурно-процессовые схемы – Грачева И.М., рисунки 1.35-1.38).

Получение товарных форм ферментных препаратов. Принципиальная схема очистки ферментных препаратов (Грачева И.М., с. 90) определяется способом производственного культивирования продуцента, локализацией фермента в процессе биосинтеза, требуемой степенью очистки.

Получение неочищенных ферментных препаратов. Неочищенные ферментные препараты представляют собой культуру микроорганизма с остатками культуральной жидкости, высушенную до остаточной влажности не более 8-12%. Неочищенный препарат может быть получен на основе поверхностной или глубинной культуры продуцента. Глубинная культура может быть очищена от твердой нерастворимой фракции или высушена вместе с ней. Сушку культур микроорганизмов осуществляют на ленточных, тоннельных, барабанных, вибрационных сушилках. Температура

Таблица 2 – Примеры производственного культивирования продуцентов ферментов поверхностным способом.

Тип препарата	Продуцент	Состав среды	Параметры ферментации
Препараты a-амилазы	Aspergillus oryzae Aspergillus awamori Aspergillus niger	Пшеничные отруби с добавлением до 25% солодовых ростков; влажность среды (40-50)%	t = (40-45)оС t = (36-48) час. рНнач. = 4,0-5,0
Пектолитиче-ские препараты	Aspergillus awamori Aspergillus foetidus	Жом свекловичный (66-70%), отруби (30-35%), добавки (NH4)2SO4, NH4Cl, (NH4)2HPO4; влаж-ность среды (55-60)%	t = 30оС первые 40 час., затем 24оС t = (36-48) час. рН нач. = 4,0-5,0
Целлюлолити- ческие препараты	Trichoderma reesеi Trichoderma lignorum Trichoderma longibrachiatum	Пшеничные отруби (60-80%), солодо-вые ростки (20%), добавки свеклович-ного жома; лузги зерновых; соломы и др.; влажность сре-ды (60-65)%	t = (35-40)оС t = (55-65) час. рНнач. = 4,0-4,5
Гемицеллю-лазные препараты	Aspergillus foetidus Trichoderma roseum	Зерновая шелуха (45%), солодовые ростки (45%), дрожжевой автоли-зат (10%); влаж-ность среды (55-60)%	t = (23-25)оС t = (50-65) час. рНнач. = 5,0-5,5
Препараты протеиназ	Aspergillus oryzae Aspergillus flavus Rhizopus oryzae	Пшеничные отруби с добавлением до солодовых ростков, соевой муки и др.; влажность среды (62-65)%	t = (40-45)оС t = (36-48) час. рНнач. = 5,6-6,2

 

Таблица 3 – Примеры производственного культивирования продуцентов ферментов глубинным способом.

Тип препарата	Продуцент	Состав среды	Параметры ферментации
Препараты a-амилазы	Bacillus subtilis	2%-й раствор крах-мала с добавками (NH4)2HPO4, KCl, MgSO4*7Н2О,CaCl2, 5%-го щелочного экстракта соевых бобов	t = (50-55)оС t = (48-60) час. рН = 7,2
Препараты полигалакт-уроназы	Zygofabospora marxiana	Молочная сыворот-ка (2%), добавки (NH4)2SO4, MgSO4 * 7Н2О, NaCl, KH2PO4, K2HPO4 * 3Н2О	t = (30-34)оС t = (80-96) час. рН = 3,3-3,5
Целлюлолити- ческие препараты	Trichoderma reesеi	Крахмал (1,5%), отруби (1,25%), 20%-й р-р NH4OH (0,6%), добавки (NH4)2SO4, K3PO4, MgSO4, СaCl2	t = (35-40)оС t = 96 час. рН = 4,0-4,5
Препараты липаз	Rhizopus oryzae	Крахмал (4%), добавки соевой муки, дрожжевого автолизата, MgSO4, кормовых дрожжей на основе биомассы Candida guiller mondii (с повышен-ным содержанием липидов).	t = (27-30)оС t = (48-50) час. рН = 5,0-6,0

 

высушиваемого материала не должна превышать 40-45^оС (температура воздуха на входе в сушильную камеру 80-85^оС).

Очистка культуральной жидкости от твердых взвесей. Большинство продуцентов накапливают большую часть синтезируемых ферментов в питательной среде, поэтому первой стадией очистки является отделение биомассы продуцента и взвешенных частиц. Очистку проводят на фильтрах различных конструкций (барабанные, фильтр-прессы) или центробехным способом на сепараторах-кларификсаторах, бактофугах.

Экстрагирование ферментов из поверхностных культур. Поскольку ферменты являются водорастворимыми белками, в большинстве случаев используется водная экстракция. С физико-химической и биохимической точек зрения оптимальные условия твердофазно-жидкофазной экстракции белковых веществ достигаются при температуре (35-40)^оС, однако для предотвращения развития микрофлоры в водных экстрактах ферментов в производственных условиях процесс экстракции осуществляют при температуре (22-25) ^оС. Для получения концентрированных экстрактов при минимальных потерях ферментов с твердой фазой используют специальные экстракционные установки (диффузионные батареи, двухшнековые экстракторы непрерывного действия), позволяющие сконцентрировать жидкую фракцию до 7-14 % сухих веществ.

Концентрирование нативных растворов ферментов методом вакуум-выпаривания. Сгущение культуральных жидкостей и водных экстрактов проводят при получении готовых форм ферментных препаратов в виде высококонцентрированных растворов, при подготовке растворов к высушиванию различными способами, а также для получения пересыщенных растворов при выделении кристаллических форм ферментов. Температура продукта при вакуум-выпаривании не должна превышать (35-40)^оС. Для концентрирования ферментных растворов применяют вакуум-выпарные установки с интенсивным тепло- и массообменном в тонком слое продукта (пленочные, пластинчатые аппараты). Такой режим обработки обеспечивает минимальное время контакта упариваемого продукта с теплоносителем.

Мембранные методы обработки ферментных растворов. Для очистки ферментных растворов от низкомолекулярных примесей при малых объемах переработки используют метод диализа (проточные диализаторы), электродиализ применяют в крупнотоннажных производствах для глубокого обессаливания. Концентрирование с одновременной глубокой очисткой от примесей осуществляют методом ультрафильтрации. Для стерилизации нативных растворов ферментов применим метод микрофильтрации.

Осаждение ферментов из растворов проводят следующими методами:

- осаждение органическими растворителями;

- высаливание;

- осаждение органическими полимерами (полиэтиленгликоль, декстраны);

- фракционирование ферментных растворов путем избирательной денатурации балластных белков при нагревании, изменении рН среды, воздействии органических растворителей.

Фракционирование и очистка ферментов от балластных белков методами адсорбции используется при получении высокоочищенных препаратов и гомогенных ферментов. В различных условиях могут быть реализованы методы ионообменной адсорбции, аффинной адсорбционной хроматографии, лигандообменной хроматографии (взаимодействие с хелатированными ионами), иммуноадсорбции, гель-фильтрации.

Получение сухих ферментных препаратов, полученных из глубинных культур микроорганизмов. Сухие формы ферментных препаратов получают из разбавленных или концентрированных культуральных жидкостей, пастообразной массы, образующейся при осаждении ферментов. Для сушки разбавленных и концентрированных растворов применяют процессы сублимационной и распылительной сушки; пастообразные массы высушивают в вакуум-сушильных шкафах.

Стандартизация ферментных препаратов. Для большинства готовых форм ферментных препаратов в технологических расчетах и нормативных документациях устанавливают средний уровень активности, превышающий на (20-30)% активность стандартного ферментного препарата. В качестве наполнителей применяют крахмал, хлориды натрия и калия, желатин, диатомит, бентонит. Наполнитель может одновременно выполнять функцию стабилизатора ферментного препарата, например, за счет высокой водосвязывающей способности. Стандартизацию можно проводить не только для сухих препаратов, но и для разбавленных или концентрированных растворов.