Технология получения концентратов и препаратов лизина.

К ПИЩЕ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Биотехнологические процессы получения нутрицевтиков.

2. Виды пробиотиков. Технология получения пробиотков на примере бактериального препарата «Бифидумбакетрин».

Характеристика БАД-парафармацевтиков, получаемых методами биотехнологии.

Направления использования БАД в технологии продуктов функционального питания.

1. Биотехнологические процессы получения нутрицевтиков.

БАД получают из растительного, животного или минерального сырья, а также химическими или биотехнологическими способами. БАД к пище вырабатываются в виде сухих и жидких концентратов, экстрактов, настоев, бальзамов, изолятов, порошков, сиропов, таблеток, драже, капсул и других форм в соответствии с техническими условиями, технологическими инструкциями, рецептурами, согласованными в установленном порядке с органами Санэпиднадзора РФ.

Наибольший удельный вес составляют БАД-нутрицевтики, крупномасштабное производство и применение которых было освоено в 80-е годы ХХ века. В 90-е годы активное распространение получили БАД, пробиотики. Относительно новым направлением в производстве пищевых добавок является разработка и производство парафармацевтиков.

Первыми в ряду БАД к пище были созданы БАД - нутрицевтики. В связи с этим данная группа БАД к пище является наиболее многочисленной и широко применяемой. Наиболее распространенные нутрицевтики - отдельные витамины, витаминные комплексы; минеральные вещества и их комплексы; витаминно-минеральные добавки.

В настоящее время в мире реализовано крупнотоннажное биотехнологическое производство ряда витаминных и аминокислотных препаратов, которые могут индивидуально или в комплексе с другими БАД использоваться в качестве нутрицевтиков в технологии продуктов функционального питания.

Получение концентратов и препаратов аминокислот представляется перспективным по трем направлениям:

- управляемый гидролиз белков животного, растительного и микробиологического происхождения, при необходимости, с последующим выделением L-изомеров из рацемических смесей;

- микробиологический синтез с использованием штаммов-сверхпродуцентов и питательных сред, допущенных к применению в пищевой промышленности;

- биотрансформация предшественников по механизму реакций аминирования и переаминирования.

В настоящее время ассортимент БАД-нутрицевтиков включает преимущественно препараты лизина, цистеина и метионина. В промышленных масштабах методами биотехнологии получают концентраты и высокоочищенные препараты лизина.

Технология получения концентратов и препаратов лизина.

Продуценты лизина культивируют на мелассных (штаммы-сверхпродуценты лизина Corynebacterium glutamicim и Brevibacterium flavum) и ацетатных (штамм Brev. sp. 22 ) средах. При использовании штаммов Corynebacterium glutamicim и Brevibacterium flavum выращивание посевного материала и производственную ферментацию проводят на средах следующего состава: меласса (по м.д. сахарозы) – 7-12%; кукурузный экстракт с содержанием СВ 50% - 1,2-1,5%; (NH₄)₂SO₄ – 2%; K₂HPO₄ и KH₂PO₄ – по 0,05%; СаСО₃ – 1%; пеногаситель –0,1%.

При выращивании посевного материала поддерживают следующие условия: температура 28-32⁰С, рН 7,0-7,2; интенсивность аэрации 50-60 м³/м³*ч. Продолжительность 18-24 ч. Посевную культуру вносят в главный ферментатор в количестве 5-10%.

Главную ферментацию осуществляют в течение 55-72 ч при аналогичных условиях и избыточном давлении 0,02-0,03 Мпа. Содержание лизина по завершении процесса до 4%, остаточное количество сахаров 0,5-1,0%.

При культивировании Brevibacterium sp. 22 на ацетатных средах концентрация уксусной кислоты в среде в пересчете на ацетат-ионы не должна превышать 2,0%. Для повышения выхода лизина используют среду следующего состава: ацетат аммония – 1,5%; глюкоза – 1,0%; K₂HPO₄ – 0,02%; (NH₄)₂SO₄ – 3%; MgSO₄ – 0,04%; гидролизат соевой муки – 1,5%. Процесс проводят при 28-32⁰С; рН 7,0-7,2; интенсивности аэрации 50-60 м³/м³*ч, продолжительность 72 ч, концентрация лизина по завершении ферментации – 34-50 г/л.

Культуральную жидкость без отделения биомассы стабилизируют 25%-ным раствором NaHSO₃ и подкисляют до рН 4,5-5,0 НС1; сгущают до 40% СВ. Таким образом получают жидкий концентрат лизина (ЖКЛ). При получении кормового концентрата лизина (ККЛ) сгущенный продукт высушивают до остаточной влажности 4-8%, гранулируют.

При производстве высокоочищенных препаратов лизина культуральную жидкость отделяют от клеток продуцента, нерастворимых карбонатов и фосфатов Са, осадок высушивают и используют в качестве кормовой добавки; пигменты выделяют из культуральной жидкости адсорбцией на активированном угле и анионитах. Раствор стабилизируют и сгущают при 60⁰С до 40 % СВ; кристаллизуют монохлоргидрат лизина охлаждением до 12-14⁰ С, кристаллы промывают чистым этанолом и высушивают под вакуумом при 60⁰ С до остаточной влажности 0,5%.

В состав комплексных БАД-нутрицевтиков и продуктов функционального питания включают препараты рибофлавина, цианкобаламина, аскорбиновой кислоты и b-каротина, получаемые методами микробиологического синтеза и биотрансформации. Рассмотрим подробнее технологические процессы производства препаратов рибофлавина и цианкобаламина.

Производство препаратов рибофлавина в настоящее время осуществляют тремя способами: химический синтез, полный микробиологический синтез, смешанный синтез (микробный синтез рибозы с последующей химической трансформацией в витамин В₂). Наиболее распространенным является химический синтез рибофлавина из рибозы, полученной путем микробной трансформации с использованием сверхпродуцентов Bac. subtilis.

Для получения медицинских препаратов рибофлавина используют промышленные штаммы Ashbya gossypii и Eromothecium ashbyii. Культура гриба Ashbya gossypii выращивают на питательной среде следующего состава: соевое масло – 4,5%; пептон – 3,5%; кукурузный экстракт – 2,25%; ростовые факторы: биотин, инозит и тиамин (биосинтез); лейцин и фенилаланин. Посевной споровый материал (0,75-2%) после проращивания в течение 24-48 ч вносят в питательную среду для главной ферментации, которую осуществляют при 28⁰С, рН начальной 7,0; интенсивность аэрации 18-20 м³/м³*ч. Продолжительность ферментации – 7 суток, выход рибофлавина 7г/л.

Eromothecium ashbyii культивируют на среде, содержащей глюкозу (5 г/л), подсолнечное масло (15 г/л), соевую муку, кукурузный экстракт, мел, К₂НРО₄, NaCl при 30⁰ С, рН 6,5-7,0; интенсивность аэрации 10-15 м³/м³*ч в течение 72 часов. Выход рибофлавина – 10-11 г/л.

По завершении ферментации культуральную жидкость нагревают до 120⁰ С и выдерживают 1 ч для выделения связанного с мицелием рибофлавина; раствор рибофлавина подвергают очистке от примесей подкисляют для стабилизации рибофлавина соляной кислотой до рН 4,5-5,0, концентрируют и кристаллизуют рибофлавин. При производстве кормовых препаратов культуральную жидкость после отделения мицелия стабилизируют соляной кислотой, концентрируют до 20 % СВ, высушивают распылительным способом, смешивают с наполнителями.

Получение препаратов и концентратов витамина В₁₂. На основе микробного синтеза получают следующие формы витамина В₁₂: цианкобаламин, гидроксикобаламин, аденозилкобаламин (коэнзим В₁₂), метилкобаламин. Для культивирования продуцентов кобаламина используют глюкозные, мелассные и лактозосодержащие среды (пропионовокислые бактерии), перспективным является использование метанола и н-алканов.

Основные промышленные продуценты Prop. shermanii, Prop. freudenreichii, Pseudomonas denitrificans. Перспективным направлением является использование метаногенных бактерий. Среда для производственной ферментации содержит мелассу инвертированную или глюкозу (до 10% по массовой доле РВ), кукурузный экстракт (3-7%); сульфат аммония (2-2,5%); соли Со (10-100 мг/л). Ферментацию осуществляют при температуре 30⁰ С и рН 6,5-7,0; первые 80 ч процесс проводят без аэрации; последующие 85-90 ч при интенсивности аэрации 2 м³/м³*ч.

Выделение и очистку кобаламина проводят по следующей схеме:

- экстракция витамина из клеток при 80-120⁰С в течение 10-30 мин при рН 6,6,5;

- отделение клеток продуцента;

- обработка раствора или клеточной суспензии раствором цианида или тиоцианата в присутствии нитрита натрия;

- сорбция кобаламинов на активированных углях, алюмогелях (Al₂O₃) и элюирование водно-спиртовыми растворами;

- экстракция кобаламинов органическими растворителями;

- концентрирование экстракта с последующим выделением осадка или кристаллов витамина В₁₂.

При культивировании продуцента Pseudomonas denitrificans биосинтез кобаламина осуществляют в периодическом или непрерывном режиме на питательной среде следующего состава: меласса – 10%; дрожжевой экстракт – 0,2%; (NH₄)₂HPO₄ – 0,5%; MgSO₄ – 0,3%; MnSO₄ – 200 мг/л; СоNO₃ – 190 мг/л; ZnSO₄ – 20 мг/л; Na₂MoO₃ – 5 мг/г; 5,6-диметилбензимидазол – 25 мг/л. Ферментацию проводят при температуре 29-30⁰ С, рН начальном 7,4; аэрации 50-60 м³/м³*ч в течение 90 ч.

Получение препарата витамина В₁₂ предусматривает термообработку культуральной жидкости с клетками, превращение кобаламина в CN-кобаламин; многоступенчатую органическую и водную экстракцию; хроматографическое выделение препарата витамина.

Перспективным направлением получения нутрицевтиков является производство витаминизированных концентратов на основе различных видов пищевого сырья с использованием сверпродуцентов витаминов группы В. Сотрудниками Института микробиологии АН РБ разработаны технологические процессы получения концентратов рибофлавина, кобаламина на сонове молочной сыворотки. С технологической точки зрения наиболее целесообразной является комплексная переработка культуральной жидкости и биомассы продуцента на пищевые концентраты, либо получение витаминизированной биомассы продуцента.

Кормовые концентраты рибофлавина получают на молочной сыворотке по следующей технологической схеме:

- культуру продуцента Clostridium acetobutylicum выращивают на лактозосодержащих или крахмалсодержащих средах при 20-22⁰ С в течение 2-3 суток, наиболее термостойкие споры отбирают методом «теплового шока»;

- посевной материал (суспензию спор) вносят в питательную среду на основе стерилизованной молочной сыворотки с добавлением ксилозы (0,5-1%); СаСО₃ (0,15%); Са₃(РО₄)₂ (0,15%); ZnSO₄ (4,8мг/л); MnSO₄ (4?2 мг/л); ионов Fe (1,2 мг/л), n-аминобензойной кислоты (0,01 мг/л) при 37-38⁰С в течение 48 ч в анаэробных условиях;

- культуральную жидкость с клетками продуцента направляют на перегонку (выделение бутанола, ацетона, этанола);

- сыворотку сгущают до 40% СВ и высушивают распылительным способом.

Кормовой концентрат витамина В₁₂ на основе молочной сыворотки получают по следующей схеме:

- посевной материал выращивают в течение 48 ч на молочной сыворотке при 35-37⁰ С и рН 6,9-7,0;

- для главной ферментации используют депротеинизированную сыворотку с добавлением 5 % гидролизованного обезжиренного молока, 5% дрожжевого автолизата, ростовых факторов (MgSO₄, CoCl₂, 5,6-ДМБ); в питательную среду вносят 3% посевного материала и культивируют при 35-37⁰ С и рН 6,9-7,0 в течение 96 ч, через 48 и 72 ч нейтрализуют мелом, первые 48 ч – в анаэробных условиях, далее при слабой аэрации;

- сыворотку с клетками продуцента сгущают до 40 % СВ и высушивают распылительным способом.

К бактериям-пробиотикам в основном относят так называемые эубиотики (представители нормальной микрофлоры кишечника и других полостей организма) и чаще всего бифидобактерии и молочнокислые микроорганизмы, называя их классическими пробиотиками. Вместе с тем, имеется достаточно фактических данных, свидетельствующих о наличии пробиотических свойств у молочнокислых палочек и кокков, не встречающихся в кишечнике человека, а также других микроорганизмов - граммположительных (Propiombactenum, Bacillus) и граммотрнцательных (Esherichia coli, Citrobacter) бактерий, дрожжей (Sabcharomyces, Candida pintolepsii) и грибов, в том числе высших (Aipergillus, Rizopus, Cordiceps).

Благоприятное влияние пробиотиков на здоровье людей проявляется разноплановыми положительными эффектами, основными из них являются следующие:

- колонизация ЖКТ пробиотическими микроорганизмами, проявляющими антагонизм в отношении условно патогенных и патогенных бактерий, вирусов, грибов и дрожжей;

- улучшение нарушенного баланса микроорганизмов в кишечнике и устранение дисбактериозов и дисбиозов в целом;

- полезная и адекватная метаболическая активность - продукция витаминов К, биотина, ниацина, пиродоксина и фолиевой кислоты; гидролиз желчных солей и холестерина, регуляция его уровня;

- нормально функционирующая микрофлора контролирует продукцию токсинов в кишечнике, предупреждая их избыточную выработку и попадание в кровоток;

- оптимизация пищеварения и нормализация моторной функции кишечника;

- детоксицирующая и защитная роль: предотвращение негативного влияния радиации, химических загрязнителей пищи, канцерогенных факторов, токсичных эндогенных субстратов, непривычной и экзотической пищи, загрязнённой воды, повышение неспецифической иммуннорезистентности.

Препараты БАД-пробиотиков содержат микроорганизмы как в виде чистых монокультур (в защитных питательных средах или без них), так и в комбинациях, чаще всего в лиофильно высушенном состоянии, реже - в жидком виде. Комбинации могут включать сочетания культур (нескольких штаммов одного рода или вида, разных таксономических групп). В последние годы получили распространение препараты, состоящие из 6 - 8 пробиотиков - "симбиотики" или “мультипробиотики”.

Наряду с симбиотиками широко применяются пробиотические продукты смешанного состава - комплексы пробиотиков, в том числе мультиштаммовых с различным пребиотическими веществами - "синбиотики". Понятие "пребиотики" используется для обозначения веществ или диетических добавок, в большинстве своем не абсорбируемых в кишечнике человека, но благотворно влияющих на организм путем стимуляции роста полезных представителей кишечной микрофлоры, т.е. пребиотики можно назвать стимуляторами, или моторами, пробиотиков.

К классическим пребиотикам относят волокноподобные неперевариваемые олигосахариды НПО - класс углеводов со степенью полимеризации 2-10. Существует 12 классов НПО: лактулоза; галактоолигосахариды; фруктоолигосахариды; лактосахароза; палантинозоолигосахариды; гликозилсахариды; мальтоолигосахариды; изомальтоолигосахариды; циклодекстрины; соевые олигосахариды; гентиоолигосахариды; ксилоолигосахариды.

В настоящее время синтетические НПО получают четырьмя методами:

1. Контролируемый гидролиз растительных и микробных полисахаридов (фруктоолигосахариды, мальтоолигосахариды, ксилоолигосахариды).

2. Выделение из растительного сырья (фруктоолигосахариды, соевые олигосахариды).

3. Химический синтез (лактулоза, лактосахароза).

4. Ферментативный синтез из простых сахаров реакцией трансгликозилирования (галактоолигосахариды, лактосахароза, фруктоолигосахариды, палатинозоолигосахариды, гликозилсахароза, гентиоолигосахариды

Эффективно увеличивают популяцию бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике микроводоросли (хлорелла, спирулина, отдельные сине-зелёные и бурые морские водоросли). Комплексные препараты пробнотнков к микроводорослей становятся популярным и широко рекламируются. Нормальная кишечная микрофлора, наряду с волокноподобными олигосахаридами, усваивает и полисахариды пищевых волокон (ПВ) -устойчивый крахмал, полисахариды растительных клеточных стенок, гемицеллюлозу, пектины, камеди.

В качестве пребиотиков безусловно могут быть рассмотрены отдельные витамины и их производные. Так, давно известно и описано селективное ростсстимулирующее действие пантотеновой кислоты и её производных на различные штаммы бифидобактерий in vivo и in vitro. Другим классом веществ, которые можно рассматривать как пребиотики, являются биологические активные иммунные белки – лактоглобулины и гликопептиды, вырабатываемые в организме человека и млекопитающих.

В настоящее время в пищевой промышленности при производстве функциональных продуктов питания используют препарат «Бифидумбактерин» на основе живых клеток бифидобактерий штаммов Bifidobacterium bifidum 1,791 или ЛВА-3. Внешний вид препарата - пористая или кристаллическая масса разных оттенков бежевого или беловато-серого цвета. Препарат имеет вид лиофилизированной кристаллической или пористой массы бежевого цвета различной интенсивности или бежевого цвета с сероватым оттенком, со специфическим запахом и вкусом. При добавлении воды образует непрозрачную взвесь.

Технологический процесс получения сухого бакпрепарата включает в себя следующие стадии:

- приготовление и стерилизация питательной среды;

- культивирование бифидобактерий на элективных питательных средах при температуре (38±1)^оС, рН среды (4,5 - 5,0) в течение 36-40ч (каждая стадия);

- отделение бактериальной суспензии на бактофуге или концентрирование культуральной жидкости без отделения клеток микроорганизмов;

- подготовку и внесение защитной среды;

- стерильный розлив во флаконы;

- замораживание и сублимационное высушивание препарата.