Лабораторная работа 10. Хроматографический метод определения аминокислот
Существует несколько разновидностей хроматографического метода анализа. Для разделения аминокислот наиболее доступным и сравнительно точным является метод распределительной хроматографии на бумаге.
Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.).
Сущность метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель всасывается хроматографической бумагой и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного растворителя употребляют, например, водонасыщенный раствор фенола, бутиловый спирт, амиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают хроматографическую бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за его фронтом.
Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином. Реакцию проводят путем опрыскивания из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,5 % спиртовым раствором нингидрина и последующим нагреванием в сушильном шкафу. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета (в зависимости от химической структуры аминокислоты). Основной физико-химической характеристикой хроматографического процесса является коэффициент распределения Kd.
Коэффициент распределения (Kd) характеризует распределение вещества между подвижной и неподвижной фазами при достижении равновесия в хроматографическом процессе. Определить Kd непосредственно из эксперимента (т.е. найти концентрацию соединения в подвижной и неподвижной фазе) довольно сложно. Поэтому в качестве основной характеристики удерживания вещества, определяющей положение его зоны на бумаге используется фактор Rf.ФакторомRfназывают отношение расстояния (в мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна ак расстоянию (в мм) от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (в):
Rf=а/в
Фактор Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и т. д.). Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот - «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму.
Исследуемые растворы аминокислот наносят вблизи центра бумажного диска, зажатого по краям. Смесь растворителей подводят к центру диска при помощи «ножек» из бумаги. Проводят разделение смеси, состоящей из трех аминокислот.
1 Цель работы – провести разделение и идентификацию аминокислот методом бумажной хроматографии
Приборы и материалы
Хроматографическая камера
Хроматографическая бумага
Электроплитка
Система растворителя - бутанол:уксусная кислота (конц.):вода в соотношении 3:1:1,4
Задача (раствор, содержащий смесь аминокислот)
Растворы аминокислот – «свидетелей» (глицин, лейцин, триптофан)
Раствор нингидрина в ацетоне 0,5 %.
Описание работы
1. Нанесение раствора на хроматографическую бумагу.
Из хроматографической бумаги вырезают диск диаметром 14 см. Диск перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг к другу, и от центра круга чертят квадрат со стороной 2 см, далее делают надрез по диагоналям квадрата; полученные в виде уголков «ножки» отгибают. На расстоянии 0,5 см от линий сгиба «ножек» простым карандашом чертят еще один квадрат, на середине каждой стороны отмечают точки. В одну точку при помощи капилляра наносят небольшую каплю исследуемого раствора смеси аминокислот. Диаметр полученного пятна не должен превышать 3 – 4 мм. В три другие точки наносят растворы аминокислот-«свидетелей», входящих в исследуемую смесь. Рядом с точкой нанесения необходимо обозначить объект нанесения (задача, название аминокислоты-«свидетеля») простым карандашом. На одну и ту же точку следует наносить по 2 – 3 капли раствора, при этом после нанесения каждой капли бумагу слегка просушивают на воздухе и лишь затем наносят следующую каплю.
2. Разделение в хроматографической камере.
Просушенную на воздухе хроматограмму помещают между двумя половинами чашек Петри с одинаковыми диаметрами, образующими хроматографическую камеру, так, чтобы «ножки» хроматограммы были погружены в органический растворитель бутанол – вода – уксусная кислота (3:1,4:1), который наливают в нижнюю чашку. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре около 40 минут. Необходимо следить за линией фронта растворителя.
Насыщенный водой бутиловый спирт в уксусной кислоте впитывается бумажным диском и движется по нему, увлекая нанесенные вещества. Дальнейшее продвижение растворителя вызывает разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью соответственно коэффициентам их распределения между водой и органическим растворителем.
3. Проявление хроматограммы.
После того как фронт растворителя пройдет 4/5 длины хроматограммы, хроматограмму извлекают из камеры, отмечают карандашом фронт растворителя и сушат на воздухе под тягой до удаления растворителя. После этого хроматограмму проявляют, опуская в 0,5 % раствор нингидрина в ацетоне, и помещают в сушильный шкаф на 5 мин при температуре 80— 100°С, также можно проявить хроматограмму, нагревая ее над электроплиткой. На хроматограмме появляются пятна сине-фиолетового цвета. С помощью линейки измеряют расстояния а – от места нанесения капли до середины каждого пятна и в – от места нанесения капли до фронта растворителя. Проявившиеся пятна обводят карандашом и вычисляют фактор Rf для каждой аминокислоты. Сопоставляя положения пятен исследуемого раствора с положением пятен «свидетелей», определяют наличие тех или иных аминокислот в исследуемой смеси.