Культивирование микроорганизмов

Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием, а развившиеся микроорганизмы – культурой. При развитии в жидких средах культуры образуют суспензию, осадок или пленку. При развитии на твердой среде – колонии. Культура может быть чистой – содержать потомство клетки только одного вида - или смешанной – в которой присутствует несколько видов микроорганизмов. В том случае, если культура состоит преимущественно из клеток одного вида, она называется накопительной.

Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называют посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом, или пассированием.

Микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах или термостатируемых комнатах. Культивирование при определенной температуре называется инкубацией или инкубированием.

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде – пробирках, колбах или чашках Петри. В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных микроорганизмов заполняют обычно 1/3 пробирки, для анаэробных – 2/3. Если плотная среда в пробирках предназначена для последующего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стерилизации ее наливают на 1/3-1/4 объема пробирок. После стерилизации пробирки с еще не застывшей средой раскладывают на поверхности стола в наклонном положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки – косые или скошенные среды. Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком. Столбики питательной среды используют для хранения культуры.

При культивировании микроорганизмов в колбах используют только жидкие среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных микроорганизмов колбу заполняют на 2/3 объема.

В чашках Петри микроорганизмы культивируют только на твердых средах.

Техника посева

Посев (или пересев) всегда производят вблизи горелки. При посеве клеток микроорганизмов из пробирки в пробирку пробирки должны находиться в наклонном положении, гарантирующем стерильность посева. При вертикальном расположении пробирок возможно попадание из воздуха посторонних клеток микроорганизмов. Непосредственно перед посевом бактериологическая петля (игла) должна быть простерилизована в пламени горелки.

Посев штрихом. При высеве в плотную скошенную среду (на косяк) бактериологической петлей с культурой легким движением, не повреждая поверхности среды, проводят прямую или волнообразную черту по ее поверхности.

Посев уколом. При посеве в столбик питательной среды иглу вводят в толщу ее центральной части.

При посеве в жидкую среду переносят культуру петлей, слегка наклоняя пробирки, чтобы избежать смачивания пробок и краев пробирок.

При посеве культуры микроорганизмов на чашки Петри можно осуществлять глубинный и поверхностный посевы. Последний является более сложным, поэтому для подсчета численности бактерий методом питательных пластин можно ограничиться глубинным посевом, а поверхностный использовать при учете численности различных физиологических групп микроорганизмов или идентификации микроорганизмов.

В случае глубинного посева берут стерильной пипеткой 1 мл клеточной суспензии и переносят в чашки Петри. Затем в чашки Петри вливают расплавленную среду в количестве 20 мл на чашку. Температура среды должна быть примерно 45⁰С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленной средой к щеке: если щеке не горячо – среду можно выливать в чашку Петри. Среду перемешивают с микробной суспензией осторожными круговыми движениями. Чашкам дают застыть, переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на поверхность среды конденсата с крышки, и помещают в термостат.

При поверхностном посеве в стерильные чашки Петри предварительно разливают по 20 мл растопленной питательной среды и дают застыть. Желательно разливать среды за сутки до проведения посева и выдержать чашки Петри со средой в термостате при температуре 30-40⁰С для того, чтобы поверхность среды подсохла. Суспензию микроорганизмов в количестве 0,05 мл стерильной пипеткой помещают на поверхность агаровой пластины и затем осторожно растирают стеклянным шпателем Дригальского по поверхности среды. Приоткрытую чашку Петри держат в вертикальном положении около пламени горелки. Шпатель непосредственно перед посевом стерилизуют фламбированием.