Выделение, фракционирование и очистка белков
Выделение белков из тканей включает несколько этапов.
1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.
2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.
3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.
4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.
а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;
б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;
в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;
г) хроматографические методы разделения:
· распределительная хроматография – по различной растворимости белков;
· гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков
· ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул
· аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков
4. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.
2.Биосинтез и распад гликогена: последовательность реакций, значение. Регуляция активности указанных процессов. Гликогенозы. Обмен гликогена в анте- и в перинатальном периоде.
Гликоген – краткосрочный резерв углеводов в организме. Биосинтез гликогена наиболее активно происходит в печени в течение первых двух часов после приёма углеводов пищи (абсорбтивный период). Глюкоза поступает в гепатоциты и другие ткани с помощью особых переносчиков (ГЛЮТ - транспортёры глюкозы).
На первом этапе глюкоза активируется за счёт АТФ под действием ферментов глюкокиназы (при высоких концентрациях глюкозы) и гексокиназы (при невысоких концентрациях глюкозы).
Затем остаток фосфата переносится в первое положение:
Далее затрачивается макроэрг УТФ с образованием активной формы УДФ-глюкозы:
УДФ-глюкоза удлиняет молекулу гликогена на одну молекулу глюкозы:
Гликогенсинтетаза - регуляторный фермент синтеза гликогена, она активируется путём дефосфорилирования.
Распаддва пути распада гликогена: амилолитический путь и фосфоролитический путь
Амилолитический путь заключается в гидролитическом распаде гликогена:
Этот путь катализируют -амилаза, которая расщепляет внутренние 1,4 --гликозидные связи и - амилаза, которая отрывает концевые остатки глюкозы.
Основным способом распада гликогена является фосфоролитический путь при участии Н3РО4:
Глюкозо-1-фосфат переходит в глюкозо-6-фосфат под действием фермента фосфоглюкомутазы.
В печени имеются фермент – глюкозо-6-фосфатаза, способный отщеплять остатки Н3РО4 от глюкозо-6-фосфата, переводя глюкозо-6-фосфат в свободную глюкозу.
Фосфорилаза расщепляет только 1,4 --гликозидные связи. В расщеплении 1,6 --гликозидных связей участвует дополнительный фермент – 1,6 --гликозидаза.
Ключевым ферментом распада гликогена является фосфорилаза. В распаде гликогена участвуют активная фосфорилированная форма фосфорилазы (фосфорилаза «А»). Она образуется из неактивной фосфорилазы «В» путём фосфорилирования и увеличения олигомерности. Фосфорилаза «В» является нефосфорилированным димером, а фосфорилаза «А» представляет собой фосфорилированный тетрамер.
Синтез и распад гликогена подвержены авторегуляции при изменении концентрации глюкозы по приведенной схеме.
