Компоненты реакционной ПЦР-смеси

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность реакции. В большинстве случаев использования ПЦР именно нуклеотидная последовательность праймера и его концентрация определяют успех реакции. Требования к нуклеотидной последовательности праймера можно свести к следующим условиям:

1. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3’-концам праймеров, т.к. именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Они видны на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос, иногда шмеров, выглядящих сплошным мазком на электрофорезе. Это мешает оценке результатов реакции, т.к. легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности;

2. Отсутствие внутренней вторичной структуры;

3. Сбалансированный состав G/C и A/T и равномерное распределение G/C и A/T по всей последовательности;

4. Отсутствие комплементарности между 3’-концами. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом;

5. Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие -ложноотрицательный результат. Иными словами, если предполагается разработать видоспецифическую тест-систему на какой-либо микроорганизм, выбирается именно та зона, которая удовлетворяет этим требованиям в пределах нуклеотидных последовательностей генома данного вида. И наоборот, в этих последовательностях должны быть как можно более существенные отличия среди всех близкородственных видов.

Считается, что оптимальная концентрация праймеров - 0.1-0.5 М. Более высокая концентрация праймеров может приводить к неспецифическому отжигу праймера и накоплению неспецифического продукта.

Термостабильная ДНК-полимераза (Thermus aquaticus(Taq-полимераза),Pyrococcus furiosus(Pfu-полимераза),Pyrococcus woesei(Pwo-полимераза)и другие) – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности. В большинстве случаев для проведения реакции достаточно 0.5-2.5 единиц Taq полимеразы. Иногда увеличение концентрации фермента приводит к уменьшению специфичности.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Несбалансированная смесь дНТФ (когда концентрация всех дНТФ не одинакова) уменьшает точность работы полимеразы. дНТФ уменьшают концентрацию свободных ионов Mg²⁺, что сказывается на активности полимеразы и снижению отжига праймеров. Как правило, если ставится задача амплификации продукта с наименьшим количеством ошибок, конечную концентрацию дНТФ уменьшают до 20 мкМ в пробе.

Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, содержащий искомую ДНК, служащий мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется. Соотношение [праймер]/[матрица] зависит от специфичности ПЦР и должно подбираться эмпирически. Слишком маленькое количество матрицы и праймеров может привести к тому, что они не смогут найти себе гомологичную пару; слишком большое количество матрицы приводит к увеличению неспецифического продукта. Чистота матрицы также влияет на выход продукта.