Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)
Molecular Beacons отличается от TaqMan тем, что концы пробы (на которых находятся соответственно метка и тушитель флуоресценции) комплементарны друг другу (Рис.8.). В результате, при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют структуру типа "ручки сковородки" (stem-loop), где зона комплементарности пробы с матрицей находится в петле.
Рис.8. Схема ПЦР «в реальном времени с использованием Molecular Beacons
При гибридизации пробы с матрицей вторичная структура разрушается, флуоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны, и флуоресценция от метки может быть детектирована.
Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)
В методике Light Cycler используется две пробы, меченые флуоресцентной меткой. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3' конце первой пробы, ко второму флуорофору, находящемуся на 5' конце второй пробы, который происходит в том случае, когда расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида (Рис.9.).
Технологии Molecular beacons и LightCycler стоят ощутимо дороже, и их осмысленно применять лишь в том случае, когда требуется крайне специфичная детекция лишь одного из образующихся ПЦР-продуктов (например, при анализе SNP).
Рис.9. Схема ПЦР «в реальном времени» с использованием LightCycler assay
Обычно SYBR Green хорошо работает примерно до C(T) = 35-37, затем точность начинает падать. Диапазон достоверности результатов легко проверить для каждой конкретной пары праймеров, проведя несколько независимых real-time PCR.
TaqMan необходим также, когда требуется проконтролировать в одной пробирке образование нескольких PCR-продуктов, как с одной пары праймеров, так и с нескольких. Однако нужно иметь в виду, что увеличение количества реакций в одной пробирке значительно усложняет оптимизацию, поэтому без необходимости это делать не рекомендуется.
Сравнение методов SYBR Green и TagMan
Применение SYBR Green накладывает очень высокие требования к специфичности реакции. Это необходимо иметь в виду при выборе праймеров. Если хорошие праймеры к интересующей последовательности подобрать не удается, имеет смысл сразу же начинать с TaqMan.
Параметры праймеров:
1. Размер ПЦР-продукта: 50-200 нп.
2. Температура плавления: 58-65OC.
3. Длина праймера: 20-30 нп.
4. GC состав: ~40-60%.
5. Вторичная структура: по минимуму.
6. Димеры: нет.
7. Минимум G/C на 3' конце праймеров (не более трех из пяти последних нуклеотидов).
TaqMan
Параметры зонда:
1. GC состав: 20-80%.
2. Температура плавления: 68-70OC.
3. Минимум одинаковых нуклеотидов подряд (особенно G: не более 4-х подряд).
4. Выбирайте ту цепь ДНК, на которой в пробе будет чаще встречаться C, чем G.
5. На 5'-конце не должно быть G.
6. Флуоресцентная метка: лучше всего FAM или VIC.
7. Тушитель: самый распространенный и дешевый - TAMRA, но лучше всего BHQ1 (Blackhole).
Параметры праймеров:
1. Размер ПЦР -продукта: около 50 нп.
2. Температура плавления: 58-60OC.
3. Длина праймера: 20-30 нп.
4. GC состав: 20-80%.
5. Вторичная структура: по минимуму.
6. Димеры: нежелательны.
· Минимум G/C на 3' конце праймеров (не более трех из пяти последних нуклеотидов).
Таблица 2.
Сравнительный анализ методов SYBR Green и TagMan
| Методика | Достоинства | Недостатки |
| SYBR Green | Значительно дешевле собрать новую реакцию, т.к. достаточно лишь заказать новые праймеры. | Невозможность работать больше, чем с одной PCR-реакцией в одной реакционной смеси. Высокие требования к специфичности реакции - любая двуцепочечная ДНК, в том числе димеры праймеров, будет генерировать репортерную флуоресценцию. Меньшая точность при малых количествах субстрата. |
| TaqMan | Возможность проведения нескольких количествленных реакций в одной смеси. Меньшие требования к специфичности реакции: репортерная флуоресценция будет генерироваться только при гибридизации пробы со специфическим PCR-продуктом. Бóльшая точность при малых количествах субстрата. | Дороговизна. Новый зонд (около $200) для каждой реакции. Меньше возможностей для оптимизации (если реакция не пошла с данной комбинацией зонда и праймеров, то, скорее всего, придется заказывать новый зонд и новые праймеры). |
Большой вклад в ошибку эксперимента вносят погрешности пипетирования. Поэтому при раскапывании образцов желательно придерживаться следующих правил:
1. Использовать все время одну и ту же хорошо откалиброванную пипетку и наконечники одной марки.
2. По возможности не работать с объемами образца меньше 2µl и объемом реакционной смеси меньше 30µl.
3. Добавлять ДНК в каждую реакцию однотипным движением (например, с полным дожимом, не перемешивая).
Материально-техническое обеспечение (Используемое оборудование и материалы для проведения ПЦР «в реальном времени»)
Для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК «в реальном времени» с флуоресцентной детекцией необходимо наличие следующего лабораторного оборудования:
· ДНК-амплификатор с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке
На сегодня существует ряд моделей приборов для ПЦР в реальном времени: это «iQ iCycler», «CFX96 Touch Deep Well Real-time PCR Detection System» (Bio-Rad), несколько типов «ABI Prism» (Applied Biosystems), «LightCycler» (Roche), «SmartCycler» (Cepheid). ПЦР лаборатория кафедры генетики БашГУ оборудована амплификатором CFX96фирмы "Bio-Rad" (рис.10).
· спектрофотометр (Nanodrop ND-1000 или аналогичный) для измерения концентрации ДНК в микролитровом объеме
· ламинар II класса защиты
· механические дозаторы переменного объема: 2-20 мкл, 10-100 мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл
· электронные дозаторы с функцией многократного дозирования
· штативы для дозаторов
· высокоскоростная центрифуга для пробирок типа 1,5 мл
· настольная центрифуга для микропробирок типа «эппендорф»
· микроцентрифуга-вортекс со сменным ротором под стрипованные пробирки
· твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур 25-1000 С
· штативы для хранения пробирок разного объема: 1,5 мл, 0,5 мл, 0,2 мл
· штативы «рабочее место» для работы со стрипованными пробирками объемом 0,2 мл.
· штативы для наконечников
· холодильник с камерой, поддерживающей температуру от 2 до 80С
· морозильник с камерой, поддерживающей температуру до -20 0 С
· ультрафиолетовые лампы
Рис.10. Амплификатор CFX96 фирмы "Bio-Rad" с компьютерным обеспечением (компьютер должен быть связан с ДНК-амплификатором для анализа результатов исследования)
Расходные материалы:
· Одноразовые пробирки типа «эппендорф» разного объема 0,5 мл, 0,2 мл
· Одноразовые стрипованные пробирки объемом 0,2 мл
· Одноразовые крышки для стрипов для проведения реал-тайм ПЦР
· Одноразовые наконечники с фильтром для пипеток переменного объема
· Одноразовые перчатки.
· Лабораторная посуда
Основные этапы работ
1. Подготовка образцов ДНК для полимеразной цепной реакции.
2. Проведение полимеразной цепной реакции «в реальном времени»
3. Анализ результатов полимеразной цепной реакции «в реальном времени».
Базовые параметры реакции
- Праймеры - 300 nM каждый;
- зонд (для TaqMan) - 250 nM;
- MgCl2 - 5 nM (SYBR Green), 3.5 nM (TaqMan);
- полимераза - AmpliTaqGold, Applied Biosystems.
Таблица 3. Базовый протокол SYBR Green амплификации
| Шаг | Время | Темпратура |
| 8 мин | 94 OC | |
| 30 сек | 94 OC | |
| 20 сек | 60-65 OC | |
| 1 мин | 72 OC | |
| Plate read (анализ образцов) | ||
| Go to 2 for 39 times (повторять с 2 температуры 39раз) | ||
| Melting curve from 60OC to 94OC read every 0.2OC hold for 1 sec before plate read (Температура плавления от 60 OC до 94 OC измеряется каждые 0,2 OC за 1 сек до стадии Plate read) | ||
| Forever 10 OC (Хранение 10 OC) |
Англ. язык приведен для облегчения работы с англоязычным интерфейсом программного обеспечения прибора
Примечания
1. Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига должна быть как можно короче. Как правило, 15-20 сек вполне достаточно для отжига праймеров на специфическом субстрате, однако в определенных случаях время отжига приходится удлинять.
2. При образовании димеров детекцию флуоресценции (Plate read) можно проводить не при 72OC, а при температурах выше температуры плавления димеров (подробнее см. ниже).
3. Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не больше 35-38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением.
4. Полимераза AmpliTaqGold может работать и при 60OC, поэтому теоретически вместо пп. 3 и 4 можно использовать 1 min & 60-65OC, но такой протокол будет в большей степени способствовать образованию димеров.
5. Кривую плавления (melting curve) двуцепочечной ДНК необходимо строить при работе с SYBR Green для определения специфичности PCR. Кроме того, при отладке реакции рекомендуется проанализировать PCR-продукты в агарозном электрофорезе.
Таблица 4.