ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ
В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ, англ. RT, reverse transcription polymerase chain reaction) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК), процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК.
Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно транскрипции, направлении.
В 1970 году Темин и Балтимор независимо друг от друга открыли фермент, названный обратной транскриптазой (ревертазой), и возможность обратной транскрипции была окончательно подтверждена. В 1975 году Темину и Балтимору была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины.
Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют фермент обратную транскриптазу (Рис.14.):
1. Реакция первой цепочки:
Комплементарная ДНК образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37°C.
2. Реакция второй цепочки:
После того как обратная транскрипция закончена и образована кДНК (cDNA) на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.
После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной кДНК. ОТ-ПЦР обычно используется при изучении вируса иммунодефицита человека, так как ВИЧ является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ (англ. HIV-Reverse Transcriptase) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.
Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов.
Рис. 14. Схема этапов обратной транскрипции
Наборы для синтеза первой цепи кДНК предназначены для получения полноразмерной первой цепи кДНК из матрицы РНК. Минимальное время получения полноразмерной кДНК – 30 мин. Стандартное время получения полноразмерной кДНК – 1 час 30 мин.
Для получения первой цепи кДНК могут быть использованы различные праймеры. Каждый тип праймеров имеет свои небольшие особенности, которые желательно учитывать при планировании синтеза кДНК.
Специфические праймеры
Избирательно работают на строго определенной мРНК. Этот тип праймеров наиболее применим для диагностических целей.