Роль каталізу в життєдіяльності організму. Ферменти як біологічні каталізатори
Усі хімічні процеси в умовах фізіологічного середовища організму (гідроліз, протоліз, фосфорилювання, комплексоутворення, окисно-відновні реакції) можуть відбуватися тільки за участю каталізаторів, які називають ферментами, або ензимами.
1. Загальні поняття про ферменти
Ферменти це речовини білкової природи, які виробляються клітинами живих організмів і значно збільшують швидкість біохімічних процесів.
Вважають, що в клітині міститься близько 10 тис молекул різних ферментів, які прискорюють понад 2 тис. реакцій. Четверта частина вивчених нині ферментів містять іони різних металів і тому їх називають металоферментами.
Ферменти, як і неорганічні каталізатори підлягають загальним законам каталізу і характеризуються рядом подібних ознак:
- каталізують тільки ті реакції, які є енергетично можливими;
- не змінюють напрямку перебігу реакцій;
- зменшують енергію активації реакцій, тим самим прискорюючи їх;
- не витрачаються в процесі реакції.
Проте ферменти мають і особливі ознаки, що пов’язані з особливостями будови.
1. Ферменти є білками і складаються з амінокислот, сполучених між собою пептидними зв’язками (первинна структура). Вони містять гідрофобні ланцюги (вуглеводневі залишки), пептидні угруповання і полярні групи: СООН, NН2, >NH, ОН, SН. Між ділянками поліпептидного ланцюга за участю полярних груп виникають водневі зв’язки, і тому макромолекули ферментів по-різному згинаються, утворюючи пухкі клубки (вторинна структура). На певній ділянці такої структури утворюється активний каталітичний центр, який складається з полярних функціональних груп, а в металоферментах ще й з йонів металу.
2. Ферменти характеризуються високою специфічністю, вибірково прискорюючи тільки певні біохімічні реакції. Наприклад, є ферменти, що діють тільки на один із стереоізомерів речовини. Висока організованість процесів ферментного каталізу визначається особливим поєднанням будови ферменту і субстрату.
3.Ферменти мають високу каталітичну активність за досить м’яких умов (температура, тиск і кислотність середовища).
4. Збільшення швидкості біохімічних перетворень, що досягається під дією ферментів, дуже велике. Так, реакція гідролізу сечовини в присутності ферменту уреази прискорюється у 1 млрд (109) разів, а реакція гідратації вуглекислого газу під дією карбоангідрази у 10 млн разів. Каталаза, що діє на реакцію розкладання Н2О2, знижує Еа процесу в 4 рази, прискорюючи її в 1 млрд разів. Одна молекула цього ферменту за 1 хв. розкладає 5106 молекул Н2О2. Така швидкість реакцій за участю звичайних каталізаторів недосяжна.
5. Швидкість ферментних реакцій залежать від концентрації ферменту, тоді як для звичайного каталізу такої строгої залежності не існує. Тому, якщо в організмі не вистачає якогось ферменту, то це призводить до зменшення швидкості перетворення тієї чи іншої речовини, що негативно впливає на стан здоров’я людини.
Для кількісної оцінки активності ферментів використовують стандартну міжнародну одиницю активності ферментів U. U кількість ферменту, що каталізує перетворення одного мікромоль (мкмоль) субстрату за 1 хв. за температури 30 °С.
Номенклатура ферментів. Назву ферментів за тривіальною номенклатурою утворюють так: спочатку називають субстрат, на який діє фермент, потім тип реакції, яку він каталізує, і додають закінчення -аза. Наприклад, назва ферменту, що каталізує окиснення спиртів, утворюється так:
Алкоголь + дегідрогенізація + -аза = Алкоголь дегідрогеназа.
Для деяких давно відомих ферментів залишають раніше вживані традиційні назви, наприклад: пепсин, трипсин, каталаза, амілаза тощо.
Назви ферментів за систематичною номенклатурою дещо складніші і розглядаються в курсі біохімії.
Класифікація ферментів. Віднесення ферменту до певного класу залежить від того, який тип хімічної реакції він каталізує. Усі ферменти поділяють на шість основних класів, які в свою чергу ще поділяють на певні підкласи. Приклади класів ферментів: гідролази (каталізують гідроліз), оксидоредуктази (каталізують ОВР), ліази (каталізують розрив звязків), трансферази (каталізують перенесення функціональних груп) та ін.
2.Механізм дії ферментів
Зростання швидкості біохімічних реакцій пов’язане зі зміною їх енергії активації, що, в свою чергу зумовлене зміною механізму їх перебігу. Наприклад, Еа гідролізу сахарози у кислому середовищі С12Н22О11 + Н2О С6Н12О6(глюкоза) + С6Н12О6(фруктоза) дорівнює 1090 кДжмоль1, а у присутності ферменту амілази 46 кДжмоль1.
Теорія ферментного каталізу грунтується на теорії проміжних комплексів.
Значний внесок у розвиток вчення про механізм дії ферментів зробили вчені Л. Міхаеліс, М. Ментен, Е. Фішер, Д. Кошланд.
За теорією Міхаеліса Ментен, процес ферментного каталізу складається з ряду стадій:
1. взаємодія активних центрів ферменту Е з реактантом (субстратом) S, що призводить до утворення фермент-субстратного комплексу ES;
2.розпад проміжного комплексу на вихідний субстрат S і фермент Е;
3.розпад проміжного комплексу з утворенням кінцевих продуктів реакції Р і вивільненням ферменту Е;
У загальному вигляді ферментна реакція відбувається за такою схемою:
де k1, k2, k3 константи швидкості відповідних реакцій.
Отже, проміжною стадією практично всіх ферментних реакцій є утворення ферментно-субстратного комплексу ES. Як і для простих каталітичних процесів, ця стадія характеризується меншою енергією активації реакції, що сприяє її швидкому перебігу і є причиною високої каталітичної активності ферментів.
За теорією Фішера утворення проміжного комплексу відбувається тільки у разі, коли просторова будова молекули субстрату точно відповідає структурі активного центру ферменту. Коли субстрат підходить до активного центра ферменту як «ключ до замка» то реакція відбудеться. Таким чином, теорія Фішера просто і наочно пояснює специфічність дії ферментів.
Проте подальші дослідження Кошланда показали, що молекула ферменту досить гнучка й еластична. Субстрат часто сам спонукає фермент до утворення відповідного активного центру, тобто конформація ферменту та його активного центру змінюються в процесі приєднання субстрату. Це дає можливість пояснити групову субстратну специфічність ферментів, тобто явище, коли різні за будовою субстрати підходять до одного активного центру ферменту. Якщо ж субстрат інший і не відповідає активному центру, то реакція не відбувається.
3.Рівняння швидкості ферментних реакцій Міхаеліса Ментен
Лімітуючою стадією перетворень
є розпад фермент-субстратного комплексу на продукт реакції Р і фермент Е. Тому загальна швидкість реакції v безпосередньо залежить від концентрації фермент-субстратного комплексу.
Залежність швидкості ферментної реакції описується рівнянням Міхаеліса Ментен:
де KМ = (k2 + k3):k1.
Константа Міхаеліса KМ чисельно дорівнює концентрації субстрату, за якої швидкість ферментної реакції дорівнює половині свого максимального значення.
Ця константа є важливою характеристикою кожного ферменту за певної величини рН і температури. Чим менше числове значення KМ, тим більшою є швидкість каталітичного перетворення субстрату цим ферментом.
За величиною KМ усі ферменти умовно поділяють на швидкі (з малою величиною KМ) і повільні (з великим значенням KМ). Для біокаталітичних реакцій значення константи Міхаеліса знаходиться у межах 101105 моль/л.
Константа k3 характеризує відносну активність ферменту. Її називають молекулярною активністю, або числом перетворень ферменту (позначають А). А число молекул субстрату, які перетворюються за стандартних умов впродовж 1 хв. на одному активному центрі ферменту, повністю насиченого субстратом. Молекулярна активність більшості відомих ферментів знаходиться у межах 1104 6106 хв1. Велике число А означає, що реакція відбувається дуже швидко. Так, для каталази це число дорівнює 5106 хв1, а для амілази 1,9104 хв1.
У медичній практиці активність ферментів визначають з метою діагностики захворювань і контролю за процесом лікування, оскільки зміна активності ферментів у патологічних станах є проявом функціональних змін в організмі. Так, за зміною активності ферменту аспартатаміно-трансферази (ACT) в крові можна діагностувати інфаркт міокарда в перші години захворювання з більшою точністю, ніж за допомогою методу ЕКГ. Збільшення активності ферменту АЛТ (аланінамінотрансферази) є надійним діагностичним критерієм гострої стадії гепатиту, а підвищення активності діастази в сечі ознакою запалення підшлункової залози.
4. Вплив температури і рН середовища на швидкість ферментних реакцій
Залежність швидкості ферментних реакцій від температури виглядає дещо інакше, ніж для звичайних хімічних реакцій. Каталітична активність більшості ферментів виявляється у вузькому інтервалі температур від 10 до 56 °С. За вищих температур руйнується білкова основа ферменту, тобто відбувається процес денатурації білків, а за нижчих перебіг ферментних процесів сповільнюється, що повязане зі зростанням в’язкості внутрішньо- та міжклітинних рідин.
На каталітичну активність ферментів також істотно впливає величина рН. При збільшенні рН швидкість різко зростає і, досягнувши певного максимуму, знову різко спадає. Концентрація йонів гідроксонію Н3О+, за якої швидкість ферментної реакції максимальна, є оптимальною для функціонування даного ферменту. Для більшості ферментів таке значення рН знаходиться в межах 4…10.
Але для деяких ферментів каталітична дія не підлягає загальним закономірностям. Так, рибонуклеаза виявляє активність практично до 100 °С і нижче 0 °С. Фермент пепсин є найактивнішим у кислотному середовищі при рН 1,0…2,2, а аргіназа, що бере участь у виділенні амоніаку з організму у вигляді сечовини, при рН 10,0…10,2.
5.Металоферменти
Ферменти, що містять у своєму складі йони металу або які ними активуються, називають металоферментами. Це досить поширена група біологічних каталізаторів, в яких йони металів можуть виконують роль як активатора, так і кофактора.Йони металів у ферментах мають такі функції:
- входити до складу активного центру;
- полегшувати зв’язування субстрату з активним центром, утворюючи проміжний місток;
- сполучатись із субстратом, утворюючи метало-субстратний комплекс, на який діє фермент.
За наявності йонів металу істотно зростає число можливих способів зв’язування ферменту з субстратом, тобто створюються умови для утворення комплексу з меншою енергією активації. Причому метали переважно діють на активний центр, тому вони є специфічними активаторами ферментів. Для функціонування деяких біокаталізаторів необхідно навіть декілька йонів металу, наприклад, фермент ацетил-КоА-синтетаза потребує різних йонів металів Mg2+, Mn2+, K+, Rb+ та NH4+. Йони металів можуть активувати ферменти не тільки шляхом комплексоутворення, під яким розуміють утворення активних центрів для ферментного процесу, але й шляхом створення відповідної конформації білкового ланцюга. Це суттєво підвищує селективність ферменту до субстрату і тому металоферменти характеризуються високою специфічністю.
Йони металів можуть входити до складу великої групи металоферментів як кофактори. Кофактор (або кофермент) небілкова частина молекул складних ферментів, яка входить до складу їх активних центрів і забезпечує катаболічну активність. Кофакторами ферментів можуть бути нуклеотиди, похідні вітамінів та деякі низькомолекулярні сполуки, що виробляються в клітині, а також йони металів Са2+, Fe3+, Mg2+, Cu2+ та ін.
Ферменти утворюються за схемою:
Кофермент + Апофермент = Фермент,
де апофермент це неактивна частина ферменту, наприклад, фермент, з якого видалено йон металу. Роль коферментів у каталітичних процесах полягає в перенесенні електронів від донора до відповідного акцептора. Саме йони перехідних металів, які характеризуються змінною валентністю, виконують цю функцію, наприклад, у складі великої групи ферментів класу оксидаз.
Біокаталітичні реакції, що відбуваються в організмі за участю металоферментів, поділяють на окисно-відновні та гідролітичні. У ролі кофакторів окисно-відновних реакцій виступають йони перехідних металів, а в реакціях гідролізу йони металів з постійною валентністю Цинку, Магнію або Кальцію. Як виняток, до складу ферментів із групи гідролаз входить Манган, який має різні валентні стани.
Приклади металоферментів
Карбоангідраза це білок з молекулярною масою 30000, що містить йони Цинку, масова частка якого становить 0,33 %. Молекула складається з 260 залишків амінокислот, має еліптичну форму, всередині якої міститься йон Цинку. Це один з найактивніших ферментів, оскільки константа швидкості реакції гідратації вуглекислого газу дорівнює 4105 6105 с1, що на сім порядків перевищує константу швидкості неферментної реакції ОН + СО2 НСО3. Цей процес забезпечує фізіологічне значення pH плазми крові в межах 7,25…7,44.
Карбоксипептидаза це один з найважливіших ферментів підшлункової залози, що містить йон Цинку і бере участь у відщепленні кінцевої аміногрупи в реакціях гідролізу білків.
Оксидази. Перебіг в організмі окисно-відновних реакцій прискорюється оксидоредуктазами ферментами, до складу яких входять йони перехідних металів. Вони або віддають електрони, виконуючи роль відновника, або переносять електрони від субстрату до проміжного комплексу. Якщо донором атомів Гідрогену є субстрат, а акцептором Оксиген, то ферменти, які каталізують ці процеси, називають оксидазами. Наприклад, різні оксидази, що містять атоми Купруму, функціонують циклічно. У біохімічному процесі почергово відбувається окиснення білка йонами Сu+2, утворення йонів Сu+ і подальше їх окиснення молекулярним киснем.
Цитохромоксидаза, що містить у складі молекули два різних йони перехідних металів Феруму і Купруму, є важливим ферментом у ланцюзі дихання, оскільки теж звязує кисень.
6.Інгібування каталітичної дії ферментів
Швидкість деяких хімічних реакцій, у тому числі й ферментних, можна сповільнити за допомогою певних речовин, які одержали назву інгібіторів. У випадку ферментних реакцій вони зменшують активність ферментів. Наприклад, каталітичну дію гемових білків гальмують такі інгібітори, як ціаніди або карбон(ІІ) оксид, ферменту АТФ-ази станум-органічні сполуки та деякі антибіотики, а карбоангідрази аніони карбонових кислот.
Активність ферментів, крім інгібіторів, знижують і деякі денатуруючі чинники температура, радіоактивне випромінювання, сильні кислоти або основи, які спричинюють необоротні зміни в активних центрах ферментів.
Вивчення впливу інгібіторів на швидкість біохімічних реакцій має значний теоретичний вплив для розуміння суті ферментного каталізу. Крім того, процеси інгібування мають і практичне значення для медицини.
Так, фармакологічна дія антибіотиків групи сульфаніламідів ґрунтується на реакції гальмування дії ферментів бактерій. Інгібітори аденозинперетворюючих ферментів (АПФ) використовують для лікування артеріальної гіпертонії, застійної серцевої недостатності, важких станів після інфаркту міокарда, а також з метою профілактики деяких захворювань нирок. Такі препарати, як каптоприл, лізиноприл, еналаприл тощо, пригнічуючи дію АПФ, нормалізують артеріальний тиск.
За характером зв’язування з ферментом інгібітори поділяють на оборотні та необоротні. Перші утворюють з ними нестійкі комплекси, які легко дисоціюють і тому активність ферменту після дисоціації відновлюється. Необоротні інгібітори міцно зв’язуються з ферментом, утворений комплекс не дисоціює і активність таких ферментів практично не відновлюється.
За механізмом дії інгібітори поділяють на конкурентні та неконкурентні.
Конкурентні інгібітори (У) мають хімічну будову, дуже подібну до будови субстрату. Інгібітор і субстрат конкурують за активний центр ферменту, причому з ферментом звязується та сполука, якої у клітині більше. Якщо вміст інгібітора більший, то замість проміжного комплексу з субстратом утворюється комплекс ферменту з інгібітором, внаслідок чого концентрація ферменту зменшується. При збільшенні концентрації субстрату він буде витісняти інгібітор з активних центрів ферменту і каталітична активність ферменту відновлюється.
Неконкурентні інгібітори безпосередньо приєднуються до каталітичних груп активного центру ферменту або, зв’язуючись з ферментом поза межами центру його активності, змінюють його конформацію. Фермент зі зміненою структурою каталітичного центру стає неактивним. Концентрація субстрату в даному разі не впливає на ферментний процес, тому єдиним способом відновлення активності ферменту є усунення інгібітора. Неконкурентним інгібітором є ціанід-іони СN, які міцно зв’язуються з йонами Fе(ІІІ) активного центру деяких ферментів, зокрема, цитохромоксидази, У результаті блокування фермент стає неактивним, перенесення електронів у ланцюзі дихання припиняється, процес клітинного дихання порушується і виникає стан гіпоксії.
Важкі метали (ртуть, свинець, кадмій або їх органічні сполуки, наприклад тетраетилсвинець) теж належать до неконкурентних інгібіторів, їхні сполуки є токсичними для організму людини, що пояснюється блокуванням SH-груп, які входять до складу активних центрів ферментів. У малих дозах іони важких металів виконують роль неконкурентних інгібіторів, а у більших виступають сильними дезактиваторами ферментів.
7. Застосування ферментних препаратів у медицині
Біокаталіз відіграє дуже важливу роль у всіх проявах життя. Тому для підвищення відпірності організму, поліпшення обміну речовин використовують ферментні препарати, які виділяють з певних органів тварин. Наприклад, при порушенні функцій органів травлення, пов’язаних з недостатнім виробленням ферментів, застосовують пепсин, панкреатин, фестал, дегістал, мезим та ін.
Для руйнування білкових утворень, що нагромаджуються у місцях опіків або при гнійних інфекціях, використовують такі ферментні препарати, як трипсин, хімотрипсин, лідазу.
Плазмін, який одержують із плазми крові людини, застосовують для лікування інфаркту міокарда, тромбозів судин головного мозку. При тромбозах судин використовують також стрептокіназу, стрептазу, а такі ферменти, як рибонуклеаза і дезоксирибонуклеаза, виявляють протизапальну дію, затримують розвиток вірусів і аденовірусів і тому їх використовують для лікування вірусних інфекцій. Для комплексного розкладання білків, вуглеводів та ліпідів застосовують препарати, до складу яких входить по декілька ферментів, наприклад: ензистал, лізим, солізим, фестал тощо.
Розділ медицини, що займається застосуванням ферментів як лікарських препаратів, називають ензимотерапією.
У наш час виробництво ферментних препаратів це важлива і необхідна галузь промисловості, наприклад, для виробництва харчових продуктів кефіру, різних видів сиру, пивних дріжджів, йогуртів тощо.