Рекомбинантты ДН туралы тсінік

Жоспары:

1.ДН рестрикциясы. Рестриктазалар,оларды трлері, асиеті жне ДН-а сер ету ерекшеліктері.

2.Рестрикциялы карта ру. Генді клондау. Геном кітапханасын ру. 3.Плазмидтерді асиеттері жне ызметтері. Плазмидті векторлар. 4.Клонындалан ДН-ны фрагменттеріні тізбегін анытау. Нуклеин ышылдарыны гибридизациясы, оны ммкіндіктері.

5.ДН-зондтар. Блоттинг, оны трлері. Саузерн-блот талдау. Нозерн-болт талдау.

6.Полимеразды тізбекті реакция (ПТР). ПТР кмегімен гендерді синтездеу.

Рестрикциялау — модификациялау былысы 50-ші жылдары байалан болатын. Рестрикция тотату деген маынаны білдіреді, ал модификация — молекуланы белгілі топтарын химиялы жолмен немесе олара баска топтарды жалау арылы згерту. Рестрикция мен модификациялау пиясын В. Арбер ашты.

Бактерияны "зіні" нуклеин кышылын "бтен" фагтарды (вирустарды) нуклеин ышылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагты нуклеин ышылын зіп, оны клеткада кбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен атар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияны зіні ДН тізбегіндегі азотты негіздерге белгілі млшерде рбір репликациядан кейін метил тобын (СН₃) жалап, модификациялап отырады. Метилденген ДН-ны рестриктаза "зінікі" санап оан "тиіспейді". Бл бактериялардаы зіндік бір "иммундык жйе" іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагты кейбір нуклеин ышылы кездейсо метилденіп кетеді. Осы ателігінен бактерияны зі фагты серінен ырылып калады. Осы былысты О. Смит, Д. Натанс жне В. Арбер ашты. Рестриктазалар табиатты ген инженериясына арнап жасаан таптырмас ралы. Бактерия р трлі боландытан оларды рестриктазалары ДН-ны ртрлі жолмен зеді.[азір 500-ден аса рестриктаза трі белгілі жне олар ДН-ны бір-бірінен згеше 120 жерінен зе алады. Яни зерттеуші рестриктазаны тандай отырып ДН-дан алаан ферментті нсмесе генді блдірмей бтін кйінде кесіп алады.

Генді бліп алу мен ген ркенін (клондарын) алу шін ртрлі объектілер (бактериялардан, сторектілер клеткаларынан, стардан т. б. алынан) жне ртрлі вирустар жтырылган ортада сірілетін ерекше ферменттер рал ретінде пайдаланылады. Негізіндс олар ш трлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза жис кері транскриптаза.

Рестриктазалар - дезоксирибонуклеазаларды ДН молекуласын ыса немесе зын болшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттерді бір трі. Рестриктазаларды ерскшеліктері ДН молекуласын кез кслген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. рбір рестриктазаны тандайтын нуклеотидтср орналасу тртібі бар. Бл детте 4-6 жп нуклеотидтер, ртрлі рестриктазалар зетін жеріндегі нуклеотидтерді рамында айырмашылыы болады. Мысалы Е. соІі рестриктазасы ДН молекуласын ГААТТЦ учаскесіндс зеді, Ват -НІ-ГГАТЦЦ учаскесінде. азір р трлі рестрикта-заларды жзден арты зіндік бірізділігі белгілі.

ДНК тізбегіні зына бойында нуклеотидтер кездейсо орналасса, тет белгілі нуклеотидтен тратын жйелілік (бірізділік) 1/256-а, ал алты нуклеотидтен - 1/4096 те болады. Сондытан рестриктазалар ДНК-ны бірнеше жздеген немесе мындаан нуклеотидтер жптарынан тратын блшектерге зеді,

Лигаза- ДН-ны бос штарын бір-біріне жалайтын фермент. Бл фермент алыпты клеткаларда ДН синтезіне жне репарация (алпына келу) процестеріне атысады, яни ДН молекуласыны біраз блінген жерлерін алпына келтіруге атысады.

Кері транскриптаза- ДН-полимераза тріздес фермент. Біра ДН-ны ДН-дан емес РН-дан синтездейді. РН-полимеразамен салыстыранда ол кері баытта жмыс істейді, яни ДН-дан РН-а емес, РН-дан ДН-а. Кері транскриптаза ферментіні алыпты сау клеткалары бар ма, жне оларда ДН синтезі РН-да жре ме? Бл кмнді сра лі толы шешілмеген. Алайда бл фермент, эукариоттар клеткаларында олара ДН арылы кбейетін РН-сы бар вирустарды жтыраннан кейін пайда болады. Бл вирустарды геномы кері транскриптазаны кодтайды, соны кмегімен ви-русты ДН-лгісі рылады да, кейін вирустар молекулала-ыны РН-сы синтезделеді.

ДН РЕКОМБИНАНТТАРЫ (БУДАН ДНЛАР)

Генетикалы рекомбинацияны мні - екі хромосоманы зара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан кп ткым уатын анытауышы бар клетканы немесе организмні пайда болуына кеп соатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті трде сторектілерді жыныс клеткалары пайда боланда, мейозды барысында гомологты хромосомалар гендсрімен алмасады (кроссинговер — айасу кбылысы). Осы алмасулар рпатара берілетін тым уатын белгілерді араласуын тсіндіруге ммкіндік бсреді.

Гендер алмасуын, сондай-а клеткаа "бтен" геиді енгізуді генетикалы рекомбинация арылы in vitro — организмнен тыс жасауа болады.

1972 жылы П. Бергті лабораториясында (АШ, Станфорд университеті) е бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДН молекуласы алынды. Оны рамына лямбда (X) бактериофагыны геномы мен 5" К40 вирус геномы кірді.

Организмнен тыс рекомбинация дісі, ор трді ДН-ларын (табии немесе жасанды) бліп алып, оларды бір-бірімен осуды, содан кейін осы рекомбинантты ДН-ны тірі клеткаа енгізіп, жаа белгіні пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жргізуді кздейді

Мндай эксперименттерді масаты ДН-даы белгілі бір нуклеотидтер жйелілігін "вектора" енгізіп, кейін клетканы ішінде жмыс істеткізу. ДН фрагментін вектормен жаластыру тмендегідей жолдармен жргізіледі:

1) ректрикциялы эндонуклеазаларды атысуымен пайда болан ДН-ны жабыса штары арылы;

2) ДН-ны рбір тізбегіне косымша полинуклеотидтер фрагменттерін синтездеу (поли-А, поли-Т);

3) Т4-лигаза ферментіні кмегімен тыл штарын жалау. 1974 жылдан бастап рекомбинантты ДН алу жмыстары кптеп жргізілді.

Кері транскриптазаньщ кмегімен иРН молекуласында ДН тізбегі синтезделеді (кДН), содан кейін иРН сілтіні кмегімен алынып тасталады да ДН-полимеразанын, кмегімен ДН-ны екінші тізбегі рылады. Экзонуклеаза ферментімен ДН-ны екі тізбегі де кысартылып, шты трансфераза арылы оларды штарына поли-Т жйелілігі тігіледі. Векторлы плазмиданы саина ДН-сын рестриктазамен кесіп желі (сызы) тріне келтіреді, содан кейін экзонуклеазамен ысартып, шты трансферазамен поли-А жйесін тігеді. Е аыры кезеде осы ДНК, молекуласыны екі типін жалап будан молекулалы синтезделген геномы бар векторлык. плазмида алады. ДН тізбегіні зілген жерлерін лигазаны кмегімен жалайды. Бл баяндалан жадайда векторлык.плазмидаа андай ген енгізілгені белгілі. Біра трансгеноз жмыстарында кбінесе кптеген ДН фрагменттері пайданылады, ал соларды ішінде бірлі-жарымында ана "керек" ген болады. Осыан байланысты ген инженериясында кажет гені бар ДН фрагменттерін табу жне оны бліп алу дісіні маызы те зор. Осы керек гені бар ДН блшегін алу шін "бытыра мылты" деп аталатын тсіл колданылады. Оны мні мынада: ДН ферменттер аркылы кптеген са блшектерге бытыратылады, содан кейін соыр туекелмен оны векторды ДН молекуласымен будандастырады. Осыны алдында векторлы ДН-ны желі тріне келтіру шін жне жабыса штар пайда болу шін рестриктазамен дейді. Ішек таяшасына рекомбинантты молекуланы кіргізгеннен со, срыптайтын оректік ортаны кмегімен ажетті гені бар ДН блшектері тскен бактерияларды бліп алады. Кірген генді оны шыаратын заты (фермент, гормон т.б.) арылы тауып алады. Бактериялар кбейгенде онын рамындаы рекомбинантты ДН еселенеді де ДН ркендері (клондары) пайда болады.

Матрицалы Рнк негізінде оан комплементарлы ос тізхбекті ДНК синтездеуді гибридтелу деп аталады. Бл кері транскрипция процесі арасында ммкін болады. Е алдымен м РНК- ны поли А шын праймермен гибридтейді. Праймер бл жерде олигодезоксириботимидинні ыса тізбегі болып табылады. Ол бос кйіндегі 3 шты алыптастыру шін жне кері транскриптаза ферменті жмысты бастау шін комплементарлы жптастыра отырып 53 баытында ДНК молекуласын синтездейді реакция німі ДНК тізбегімен комплементарлы жптасан РНК матрица тізбегінен тратын гибритті молекула . In Vitro жадайларында бл процесті жргізгенде жалыз практикалы иыншылы бар. Кері транскриптаза ферменті м РНК – ны 5 шына жетпей кез- келген нктеде тотап алуы ммкін . Ал м РНК – ны 5 шына жетсе , фермент синтезделетін ДНК- ны шында тза тзеді . Яни тзілген ДНК- ны 3 шында 10-20 нуклеотид жбынан тратын иілім пайда болады . Осы кезеде м РНК матрицаны сілтімен деу арылы ыдыратады. Нтижесінде мРНК –а комплементарлы 1 тізбекті ДНК тзілуі . Оны к ДНК деп атайды . Оларды 3 шындаы иілім ДНК полимераза бір ферменті шін праймер болып табылады. ДНК полимераза бір ДНК –ны комплементар тізбек синтездеу арылы ос тізбекті ДНК-а айналады. Реакция німі шында иілім бар 2 тізбекті ДНК молекууласы иілімді нуклеовза

S1 ферменті арылы кесіп, кдімгі екі тізбекті ДНК алады. Оны ары арай синтетикалы генні кп млшерін алу шін клоундауа болады. Мндай клонды кДНК клоны деп атайды. Клондау техникасы генетикалы материалдардан жеке гендерді тікелей алуа кп олданылады.рбір жеке ген эукариоттарыны геномыны те азантай блігі болып табылады. Мысалы: сторектілерді геномыны млшері 10⁹ нуклеотид жбын райды.Ал орташа гендер шамамен 5 мы нуклеотид жбтарынан трады, яни ядродан РНК-ны 0,0005 осындай болар болмас материалды идентификациялау шін арнайы заттар пайдаланады. Яни бл дісте табаланан радиоактивті РНК немес ДНК заттар пайдаланады. Бл кезде туындайтын иынды арнайы белока сйкес келетін мРНК алу бл шін арнайы діс “Гибрид тншытыратын трансляция дісі пайдаланады” Бл дісті негізінде кДНК –ны м РНК-ны гибридтеліп, оны трансляциясына кеергі келтіру, асиеті жатады. Брыны уаыттарда гендерді бліп алуда мРНК пайдаланан, Ал азіргі уаытта химиялы траты кДНК пайдаланады. ДНК-ны бір тізбекті фрагменттенрге денатурациялап, одан со тзілген фрагменттерді фильтрге ауыстырады. Сол кезде олар имобилизацияланады. Бл сарыш аазбен, су сііруге сайды. Осы дісті ойлап тапан алымдарды атымен Саузерн блоттинг деп аталады. Нитроцелилозамен имобилизацияланан фрагменттерді радиоактивті зондпен In Vitro жадайларында гибридтеуге болады. Бл жадайда діс Нозерн Блотинг деп аталады.

Бкіл геномдарды ДНК-рын клондауды Шотган эксперимент деп атайды.Бл шін геномды олайлы фрагменттерге бледі.Одан со фрагменттерді клондалатын вектора тіркесіп, химералы векторлар алады. Осындай фрагменттер жинаын геном библиотекасы деп атайды. Осындай жолмен алынан бактериофагтарды немесе плазмидалы векторды шексіз за уаыт сатауа болады. Осы белоктардан бір-бірін клонды селекциялап, іріктеп алу шін гибридтеу дісі олданылады.

Лекция 15