Промежуточные филаменты, 10 nm
Актиновые микрофиламенты, 5-9 nm толщиной
· Есть в любых эукариотических клетках, состоят из двух перекрученных цепочек из молекул глобулярного актина, некоторых сократительных белков: миозина, тропомиозина, актинина, и других (винкулин, фрагмин, виллин) и имеют диаметр около 7-8 нм. Обладают полярностью, т.е. (+) и (–) концы неравноценны по строению, способности присоединять новые молекулы актина и т.д. Процессы сборки и разборки постоянно идут на обоих концах – динамическая нестабильность. Непосредственно участвуют в:
· изменении формы клетки при распластывании
· формировании сократительного кольца при цитотомии (делении перетяжкой)
· прикреплении к субстрату
· амебоидном движении
· эндомитозе
· перемещении везикул в клетках животных и растений
· циклозе (движении цитоплазмы) в растительных клетках
· мышечном сокращении
· формировании адгезивных межклеточных контактов (пояс адгезии) и контактов между клеткой и внеклеточным матриксом - фокальный контакт
· Места опосредованного прикрепления некоторых мембранных белков-рецепторов.
· В клетках кишечника позвоночных — поддержание микроворсинок
У млекопитающих 6 изоформ актина: - в мышечных клетках, и -актин в немышечных.
Микротрубочки, (тубулины), 25 nm, центросома
Состоят из протофиламентов из гетеродимеров альфа- и бета-тубулина, полярны (+ конец со стороны бета-тубулина), используются для организации веретена деления, анизотропного транспорта в цитоплазме и поляризации клеток, формирования длинных клеточных отростков. Характеризуются динамической нестабильностью, когда рост сменяется быстрой деполимеризацией. Моторные белки – динеины и кинезины.
Центросома – основной ЦОМТ (центр организации микротрубочек) в клетке млеков, затравка для их появления.
Промежуточные филаменты, 10 nm
· Участие в создании прочной формы клеток и механической устойчивости. Взаимодействие с другими компонентами цитоскелета и плазматической мембраной.
· К категории ПФ относятся ламины, которые образуют ламину внутри ядра. Через белки-посредники ПФ цитоплазмы связаны с ламинами.
· Участие в распределении органелл и поддержание их локализации внутри клеток.
· Участие в движении липидов (ферменты метаболизма холестерина).
· Участие в создании адгезивных контактов между клетками (десмосомы) и между клеткой и внеклеточным матриксом (полудесмосомы). Поддержание целостности тканей.
· Участие в передачи сигналов внутри клеток.
Нет у высших растений и насекомых. ПФ строятся из фибриллярных мономеров, при созревании подвергаются компактизации и очень стабильны (время полуобмена порядка часов, обмен субъединицами по всей длине).
26. Микрофиламенты
Есть в любых эукариотических клетках, состоят из двух перекрученных цепочек (F-актин) из V-образных глобул G-актина. В полимере глобулы связаны продольными и поперечными связями и направлены в одну сторону, т.о. появляются оперённый (+) и заострённый (-) концы. Начинается образование филамента с нуклеации – появления ядра, затравки: тримера G-актина. Это довольно медленный процесс, т.к. сродство одного мономера к другому невелико. После появления ядра он идёт быстрее (элонгация), причем на + конце тоже быстрее, чем на – конце. Когда скорость полимеризации оказывается равна скорости деполимеризации, говорят о критической концентрации мономеров (равновесие). При этом может получиться, что на (+) конце преимущественно сборка, а на (-) конце разборка, и цепь микрофиламента движется от (+) конца к (–) концу, имеет место тредмиллинг («нарезание резьбы», круговорот мономеров).
Мономерный актин способен присоединять АТФ и АДФ. В полимерной форме он приобретает способность также самопроизвольно гидролизовать АТФ, тогда сначала получается актин с АДФ+Фн, затем постепенно диссоциирующий в АДФ-актин. NB: АТФ не нужен для полимеризации! Однако прочность соединения АТФ и АДФ+Фн связанных мономеров актина значительно больше чем связанных с АДФ, таким образом нуклеотиды регулируют постройку и разборку микрофиламентов. Также, именно АТФ-актин имеет сродство к + концу, именно он обуславливает их кинетическое различие.
Регуляция микрофиламентов.
Тимозин b4 (только высшие эукариоты и в основном подвижные, способные к фагоцитозу клетки) связывается с мономерами G-актина и ингибирует присоединение к филаментам. Профилин(почти все эукариоты) связывается с мономерами актина и полностью прекращает достройку с – конца. Способен обменивать нуклеотид у мономеров актина, пополняя таким образом количество АТФ-связанных мономеров.
Белки нуклеации: семейство Arp2/3 (обеспечивают ветвление филаментов, связывается с АТФ и АДФ+Фн актинами и диссоциируют на старых филаментах с АДФ-актином; именно их активируют сигнальные белки WASP/Scar) и формины (помогают нуклеации, защищают + от кэпирующих белков, создают неразветвлённые филаменты).
Кэпирующие белки CapZ и гельзолин садятся на оперённый конец и предотвращают дальнейшую полимеризацию.
Актиндеполимеризующий фактор (ADF)/кофилин обеспечивают разрезание и диссоциацию старых АДФ-филаментов.
Специфические ингибиторы микрофиламентов: цитохалазины B, D – дезорганизуют микрофиламенты в хаотичную систему коротких фибрилл. Приводят к нарушению формы клетки и уменьшению её механической прочности, обратимо. Используют для получения кариопластов и цитопластов. Латрункулин А – связываясь с G-актином деполимеризует микрофиламенты обратимо. Уменьшает механическую прочность и нарушает форму клетки.Фаллоидин (яд бледной поганки) – стабилизирует микрофиламенты взаимодействуя с F-актином.
Структуры: в основном представлены плотно упакованными пучками (связаны фимбрином, фасцином, виллином), рыхлыми пучками (a-актинин) и сетевыми структурами (филамин).
Где встречаются: разнообразные выпячивания цитоплазмы, филоподии и псевдоподии, микроворсинки и акросомальные выросты, стереоцилии и адгезивные контакты, кортикальные сети.
27. Моторные белки – миозины
Миозины – белковые моторы, использующие энергию гидролиза связанного АТФ для реализации движения вдоль актиновых филаментов (все кроме миозина-VI – в сторону оперённого конца). То или иное из 18 их семейств можно обнаружить в любых эукариотических клетках. Так, миозин-II обеспечивает мышечное сокращение, миозин-I связывает липидные мембраны с актиновым цитоскелетом и участвует в везикулярном транспорте при эндоцитозе и фагоцитозе, миозин-VII связывает актиновый цитоскелет с внеклеточными матриксами, миозин-III взаимодействует с сигнальными молекулами фоторецепторов глаза.
Миозины обычно состоят из трёх доменов:моторного (связывание и гидролиз АТФ), регуляторного (связывание легких цепей из белковкальмодулинов, изменяющих характеристики миозина в ответ на фосфорилирование или концентрацию ионов Ca2+) и хвостового(позволяет миозинам образовывать димеры и филаменты, определяет природу карго).
Собственно движение происходит за счёт изменения сродства к актину в процессе связывания и гидролиза АТФ, диссоциации Фн и АДФ, смотри картинку. Выделяют такой параметр как коэффицент загрузки– долю времени в цикле, когда миозин прочно связан с актином. Например, в толстых миозиновых филаментах мышц коэффициент загрузки небольшой, т.к. белку надо быстро отсоединиться от актина, чтобы не мешать другим моторам. Напротив, транспортирующие органеллы димеры миозина-V не должны одновременно отсоединяться от актинового филамента, т.к. вся конструкция может сбиться с пути и улететь, поэтому у них КЗ около 50%. Грубо усредняя, одна молекула миозина даёт усилие в 5-10 пН на молекулу АТФ и перемещается на 5-25 нм за шаг.
Активация миозина-II происходит посредством фосфорилирования легкой регуляторной цепи соответствующей киназой MLCK, а ингибирование – дефосфорилированием фосфатазой MLCP, которые в свою очередь регулируются сигнальным каскадом с белками семейства Rho и ионами кальция.
28. Аппараты клеточной подвижности
Очень странный вопрос. Смотри билет 30 и имей в виду:
Движение актимиозиновых комплексов непроцессивное (один мотор тянет недалеко, менее 1 мкм) у животных и процессивное (циклоз) у растений. Движение по МТ процессивное (сальтаторные – движения рывками) у животных и непроцессивное у растений. Во время деления МТ обеспечивают сначала сальтаторные движения хромосом, а потом медленное процессивное расхождение.
30. Механизм движения клеток по субстрату
Ворнинг:речь в основном о фибробластах!
Стресс-фибриллы – комплекс актиновых микрофиламентов с миозином-II, способные к сокращению филаменты – оканчиваются соединёнными с ними адгезионными комплексами (фокальными контактами), служащими для связи с внеклеточным матриксом (обычно фибронектин). Незрелый контакт состоит из интегринов, талина, паксилина (см. картинку). В зрелом белков много (зиксин, винкулин, паксиллин). Важный сигнальный белок – тирозин киназа 2 (FAK). Размеры первичных контактов 0.3-0.5 мкм, зрелых – до 5 мкм.
Микрофиламенты на краю клетки могут образовывать параллельные пучки и сеть.
Край распластанной клетки: стабильный (микрофиламенты идут вдоль поверхности) и активный (микрофиламенты упираются в мембрану под углом 0-35 град). На активном краю возникают филоподии и ламеллоподии.
Филоподия (пучок) имеет диаметр около 0,1 мкм, ее длина достигает нескольких мкм. Время жизни свободной филоподии – около 1 секунды; прикрепленная к субстрату филоподия натягивается; свободная филоподия втягивается.
Ламеллоподия (сеть) имеет ширин у до нескольких десятков мкм, толщина у неё около 0,2 мкм, длина – несколько мкм. Время жизни свободной ламеллоподии – около 10 секунд; прикрепленная ламеллоподия натягивается и остаётся тонкой (с помощью стресс-фибрилл), свободная (не прикрепившаяся) ламеллиподия втягивается (раффлинг).
Последовательно выдвигающиеся и прикрепляющиеся к субстрату ламеллиподии формируют ламеллу – уплощенную часть клетки, которая может иметь протяженность в десятки мкм
Собственно мезенхимное движение обеспечивается выбрасыванием ламеллы, закреплением к субстрату посредством фокального контакта и втягиванием актинового кортекса. Два вида перемещения: быстрое (скольжение) слабо прикреплённых или медленное (блуждание) хорошо прикреплённых клеток. В отличие от амебоидного движения с образованием ложноножек, или от движения с помощью жгутиков/ресничек.
Один из каскадов регуляции -- Rho-белки (G-белки, АТФ-связанные белки), участвует в передаче сигналов из внеклеточного пространства и передают сигнал на Rho-киназу, дальше киназа фосфорилирует легкую цепь миозина, фосфорилирует кофилин и ингибирует процессы разрезания и деполимеризации актина. Когда легкая цепь миозина оказывается фосфорилированной, то усиливается активность миозина и стресс-фибриллы способны к сокращению.
Rhо-GTP активирует формин и способствует росту пучков в актине. Cами пучки могут менять, и за счет активности Rho-киназы усиливать сокращение.
Другой каскад – тоже с G-белков, через WASP/Scar идёт активация Arp2/3.
29. Актомиозиновые комплексы немышечных клеток
· Миозин-I – в микроворсинках, в транспорте везикул в кортексе
· Миозин-II – в стресс-фибриллах (см. 28), контрактильном кольце в цитокинезе, адгезионный поясок изменяет форму эпителиоцитов
· Миозин-V – транспорт везикул, регулируется степенью фосфорилирования или связью с белками семейства Rab.
31. Актомиозиновые комплексы в мышечных клетках
В поперечнополосатых мышцах миозин-II состоит из шести белковых цепей и связывается в волокна примерно из 300 молекул. Это толстые биполярные филаменты, т.к. моторные домены всех молекул направлены от центральной зоны.
Мышца же состоит из волокон, в сущности – длинных многоядерных клеток, которые в свою очередь – из миофибрилл с саркомерами.
Оперённые концы актиновых филаментов с одной стороны прикреплены к т.н. Z-диску саркомера, при этом у них одинаковая полярность и присутствует кэп CapZ (зелёный).
Заострённые концы направлены к центру саркомера и несут кэп тропомодулина. Регулирует сборку филаментов небулин. Хвостовые части молекул толстых филаментов лежат на средней H-полосе, со стороны моторных доменов их с Z-диском эластично связывает и центрует титин.Темная область, соответствующая толстым филаментам = A-диск. Светлая область с центром в Z-диске = I-диск. Ровно пополам делит саркомер М-линия.
При сокращении саркомера Z-диски сближаются, и относительное смещение одинаково для всех саркомеров в миофибрилле. Прирост силы достигается за счёт увеличения количества миофибрилл.
Сокращение мышц регулируется тропонин-тропомиозиновым комплексом, связанным с актиновыми филаментами. При низких к-циях Ca2+ тропомиозин пространственно блокирует сайт связывания миозина на актине и мышца расслаблена, гидролиз АТФ почти не идёт. При поступлении нервного импульса кальций выходит из саркоплазматического ретикулюма и связывается с тропонином-C. В результате происходит конформационное изменение в тропомиозине, и ничто больше не мешает работе миозина.
32. Промежуточные филаменты (см. 25)
Средним диаметром около 10 нм, кодируются несколькими крупными семействами генов. В нормальных физиологических условиях могут занимать до 80% массы белка в клетке, но функции их проявляются на тканевом уровне. Разделены на шесть типов. Белки ПФ обнаруживают сходное строение: центральный стержень, состоящий из консервативной альфа-спирали, и вариабельные хвосты. Самые прочные из филаментов: растягиваются, но не рвутся.
Большинство белков промежуточных филаментов у человека это кератины, связанные с межклеточными контактами (десмосомами) и контактами с матриксом (полудесмосомами). Их экспрессия является признаком эпителиальной ткани. Там они обычно экспрессируются парно, тип I/тип II, и образуют филаменты комплементарно. Функционально их можно разделить на простые (самые древние и наименее дифференцированные, в эмбриональных клетках), барьерные (в сложном стратифицированном эпителии) и структурные (только в специализированных тканях типа волос и ногтей). Виментин(все клетки млеков), GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) экспрессируются в клетках соединительной ткани, мышц, в нейронах и некоторых других клетках. Десмин обеспечивает упругость мышечной ткани при физических воздействиях. Периферин (и пред. – тип III) экспрессируется в клетках периферической нервной системы при росте аксонов. Факинин (CP49) и филензин (тип VI) образуют ПФ в клетках хрусталика. Нестин, NF-L, NF-M, NF-H (тип IV) – белки нейрофиламентов.
Отдельный случай промежуточных филаментов – ламины(тип V), внутриядерные белки, формирующие ламину, выстилающую ядерную мембрану. Также считаются древними, обнаружены в цитоплазме беспозвоночных. Разделяют ламины А-типа (А, C1, C2) и B-типа (B1, B2, B3). Они экспрессируются с альтернативным сплайсингом и модифицируются, чтобы прикрепляться к яд. мембране. Способ сборки филаментов отличен от такового у других ПФ, поэтому они не образуют неправильных пар.
33. Микротрубочки
Состоят из 13 протофиламентов – полимеров из гетеромеров альфа- и бета-тубулина, встречающихся строго попарно. Обладают полярностью: бета-тубулин с (+) конца, там скорость полимерзации больше; альфа-тубулин с (-) конца, там скорость меньше. Тубулин способен к самостоятельной нуклеации и сборке в микротрубочки in vitro, но in vivo скорость обмена димеров выше – имеют место затравки полимеризации и регуляторные белки. Особенность : динамическая нестабильность, когда каждая микротрубочка периодически переходит от удлинения (спасения) к деполимеризации (катастрофе), в обоих случаях с (+) конца. Это происходит из-за связи полимеризации тубулина с гидролизом ГТФ: присоединяется скорее ГТФ-связанный тубулин, но следующий присоединяющийся димер катализирует гидролиз до ГДФ. Получается, ГТФ-кэп не может быть глубоким. ГДФ-тубулин образует изогнутые протофиламенты с меньшей способностью к образованию боковых связей. Таким образом, если на (+) конце в какой-то момент пропадает ГТФ-кэп, начинается быстрая деполимеризация (катастрофа). Спасение, видимо, также статистически обусловлено (в фибробластах до спасения обычно деполимеризуется 11 тыс. мономеров).
Онищенко: гетеродимеры тубулина полимеризуются при 37 град. C с гидролизом одной молекулы ГТФ. Второй ГТФ гидролизуется позднее, уже в составе микротрубочки.
Почти во всех клетках инициация сборки МТ идёт на затравке -- т.н. ЦОМТ (центре организации микротрубочек). У млеков это центросома из пары центриолей (из девяти триплетов МТ) и перицентриолярного материала, в которые входят вдобавок гамма-, дельта- и эпсилон-тубулин. Ключевым для сборки МТ является гамма-тубулиновый кольцевой комплекс (у-TuRC), входящий в перицентриолярный матрикс и немного похожий на разрезную шайбу. Очевидно, он оказывается соединён с (-) концом образуемой МТ. Иногда МТ отсоединяются, иногда остаются связаны с центросомой (тогда она чаще всего оказывается в геометрическом центре клетки). При делении центросомы рядом с каждой центриолью появляется дочерняя, и каждая новая клетка получает одну материнскую и одну дочернюю центриоль.
Другой вариант затравки в подвижных клетках млеков (напр. сперматозоидах) – базальное тело, основа жгутиков и ресничек. Оно не парное, не несёт перицентриолярных белков, микротрубочки на нём полимеризуются соосно собственным и не могут отсоединяться в нормальных условиях. У грибов эквивалент центросомы – полярное тело веретена деления в ядерной оболочке.
Время полуобновления МТ в митозе – около 20с, в интерфазе 3—20 мин.
Обычно существует две популяции микротрубочек: динамичная и стабильная, в неделящихся клетках стабильных больше, и наоборот. Стабильная МТ – связанная с ЦОМТ и зачастую с кэпированным (+) концом. В клетках может идти тредмиллингМТ, если (-) конец свободен и скорость присоединения на (+) конце такая же – происходит круговорот мономеров. Этот процесс требует участия дополнительных белков и не идёт в растворе тубулина.
Динамичные микротрубочки позволяют реализовать механизм поиска и захвата при образовании веретена деления (в это время МТ остаются только в составе веретена), когда центросомы нуклеируют образование МТ во всех направлениях, а не обнаружившие кинетохора МТ быстро диссоциируют, освобождая мономеры для других. Достигшие цели МТ оказываются кэпированы и остаются. Аналогичным образом работает сигнализация через фокальные контакты (см картинку).
Обычно у животных (-) конец в центре, (+) конец на периферии. Подвижные клетки часто имеют радиальную систему МТ с одним центром схождения и нестабильными (-) концами. Эпителиальные клетки несут продольную систему МТ, со стабильными (-) концами обращёнными к апикальной поверхности. У нейронов (+) конец МТ обращён к дистальной части аксона.
МТ растений очень нестабильны, быстро деполимеризуются с (-) конца. Часто образуют пучки вдоль плазмалеммы.
Белки, ассоциированные с МТ: MAP2 и tau, в нейронах, прикрепляются вдоль тела МТ (вообще MAPs – латерально связанные) и защищают от деполимеризации. Группа «+TIPs» связывается только с растущими (+) концами: семейство EB(стимулируют спасение), CLIP-170 (стабилизирует МТ и способствует присоединению эндосом), CLASPs(стимулируют спасение).
Дестабилизирующие белки: катанин (режет МТ с гидролизом АТФ), MCAK (кинезин, связанный с митотической центромерой, дестабилизирует + конец).
Специфические ингибиторы МТ: колхицин (колцемид), нокодазол – деполимеризуют МТ, связываясь с растворенным тубулином, в низких дозах подавляют динамическую нестабильность. Винбластин (винкристин) – деполимеризуют МТ, связываясь с тубулином и образуя паракристаллы. Таксол (паклитаксел) – стабилизирует МТ, уменьшая константу деполимеризации.
Все ингибиторы в низких дозах останавливают клеточное деление. На уровне организма млеков деполимеризация МТ вызывает симптомы острой лучевой болезни.
34. Моторные белки – динеины и кинезины
Практически всё полезное, что делается с МТ, происходит посредством моторных белков, использующих гидролиз АТФ для циклического движения вдоль МТ. Это образование веретена деления, перемещение хромосом, обеспечение подвижности некоторых внутренних мембран, движение жгутиков и ресничек, транспорт везикул и даже вирусных частиц.
Кинезины – плюс-моторы (направляются почти всегда к +концам МТ), динеины – исключительно минус-моторы. Оба эти класса обычно представлены олигомерами, состоящими из тяжёлых цепей с моторными доменами, их спирализованных хвостов и регуляторных лёгких цепей. Соединение с карго происходит посредством адаптерных белков (Arp-1 и динеин).
Кинезины делятся на три группы: «обычный» с моторным доменом у N-конца цепи, (+) мотор; менее обычные с моторным доменом у C-конца, (-) моторы; и совсем странные с моторным доменом посередине (например MCAK – кинезин, связанный с митотической центромерой), которые вообще не выполняют транспортную функцию а катализируют МТ.Кинезины осторожно перешагивают точно по нуклеотидам.
Динеины же в цитоплазме представлены всего одним гомодимером с двумя моторными доменами в каждой тяжёлой цепи. Остальные белки флагеллярные и находятся в жгутиках и ресничках. Взаимодействуют с МТ посредством ножки, и прикрепляются к протофиламенту где попало.
Шаг МТ-моторов равен 8 нм.
У животных движение по микротрубочкам процессивно (идёт на большие расстояния, моторный белок не отрывается от филамента), а у растений непроцессивно. С актином-миозином наоборот.