РОЗДІЛ 2. ВИЯВЛЕННЯ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ГЕНЕТИЧНО МОДИФІКОВАНИХ МАТЕРІАЛІВ У ХАРЧОВІЙ ПРОДУКЦІЇ

Загальна характеристика методів аналізу ГМО

Виявлення модифікованих об'єктів (ГМО) у рослинній сировині, продуктах харчування, тваринних кормах та постреєстрацйний моніторинг трансгенних організмів потребує розробки надійних методів детектування, ідентифікації та кількісного аналізу ГМ продукції. Розвиток та стандартизація методів виявлення ГМО в експериментальних зразках рослинного або тваринного походження необхідні для визначення та реалізації правил маркування продукції такого типу. Сучасний розвиток ГМ-технологій та стандартизація методів контролю ГМО потребують безпомилкового визначення в експериментальному матеріалі присутності дуже малої кількості трансгенних ДНК.

Ідентифікація ГМО теоретично може здійснюватися за різними критеріями: оцінка за фенотиповими ознаками, визначення специфічних РНК, аналіз синтезованих білків та метаболітів або безпосереднє детектування вбудованих трансгенних конструкцій на молекулярному рівні. Методи детекції ГМО повинні відповідати наступним критеріям:

1. Можливість детекції різних видів ГМО.

2. Забезпечення кількісної інформації про наявність ГМ-матеріалу в біологічному об'єкті.

3. Наявність інформативних результатів, які охоплюють широке коло продуктів харчування та сільськогосподарської продукції.

4. Забезпечення максимально коректної оцінки результатів.

5. Забезпечення чутливості та відтворюваності результатів аналізу.

Серед поширених методів ідентифікації ГМ рослин можна виділити біологічні методи оцінки та аналізу фенотипів ГМ рослин; методи, що базуються на визначенні специфічних білків, синтезованих трансформованими рослинами та методи аналізу ДНК на наявність елементів привнесеної генетичної конструкції.

Методи аналізу фенотипу

Методи аналізу фенотипу відносяться до «низькотехнологічних» засобів та дозволяють виявити наявність специфічних ознак в ГМ рослинах (у більшості випадків - це стійкість або толерантність до гербіцидів). Проведення таких тестів включає оцінку здатності рослини до росту після обробки специфічним гербіцидом.

2.3. Методи визначення специфічних білків, синтезованих трансформованими рослинами (імунодіагностика)

Принцип методу полягає у детекції нових білків, які утворюються внаслідок генетичних модифікацій рослин, основою якого є ідентифікація комплексу антиген-антитіло. Цей спосіб детекції є специфічним і потребує відносно простого підготовчого етапу для аналізованих зразків. Для ефективної оцінки присутності молекули-мішені (в даному випадку - білку ГМ організму) в експериментальному зразку необхідно забезпечити умови виключення блокування сайту зв'язування антигену з антитілом (відсутність у зразку фенольних компонентів, жирних кислот та ендогенних ферментів, що кон'юговані з антитілом). Ефективність проведення аналізу також залежить від характеристик антигена (величини гідрофобності та третинної структури).

Найбільш розповсюдженим типом імунодіагностики є Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Цей метод дозволяє виявляти білки, які є типовими для існуючих сьогодні ГМ рослин, зокрема, EPSPS, Bt, Cry 1 Ab та PAT.

Імуносорбентний аналіз (ELISA) проводять у кілька етапів. На поверхню твердої підложки (наприклад, пластикової плашки для мікробіологічного титрування) наносять специфічні антитіла та додають антиген (розчин, що містить білок-мішень). Після цього промивають лунку для вимивання компонентів, які не зв'язались, та додають другі антитіла, специфічні до антигенної складової білка-мішені. Другі антитіла попередньо кон'югують з ферментом для подальшого проведення ферментативної реакції з утворенням забарвленого продукту. Таким ферментом найчастіше є пероксидаза хріну чи кисла фосфатаза. Після проминання в лунку додають субстрат для ферменту, що каталізує перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт реакції, кількість якого пропорційна концентрації зразка. Кількісну або якісну оцінку проводять спектрофотометрично.

Рис. 1. Загальна схема постановки імуносорбентного аналізу

Антитіла можуть бути поліклональними (отримують з сироватки крові імунізованих тварин), які зв'язуються з різними антигенними детермінантами молекули-мішені, та моноклональними (отримують з клітинних культур), які є специфічними до однієї антигенної детермінанти.

Однією з різновидностей тесту ELISA є детекція ГМО у листках чи насінні рослин за допомогою індикаторних смужок. Принцип методу полягає в тому, що на мембрану смужки нанесені антитіла з високим ступенем спорідненості до відповідного епітопу молекули антигена. Мембрана містить дві зони зв'язування: одна для чужорідного білка, інша для кольорового реагенту. Після занурення смужки у розчин з екстрактом зразка, який містить чужорідний білок, відбувається зв'язування більшої частини антитіл з антигеном; частина з антитіл залишається зв'язаною виключно з кольоровим реагентом.

Рис. 2.Принцип детекції ГМО за допомогою індикаторних смужок

Наявність однієї лінії після проведення аналізу свідчить про негативний результат, а наявність двох - про позитивний. Метод є досить ефективним та дає 90%-ний результат при наявності у зразках не менше 0,15% ГМО.

Методи аналізу ДНК.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) відноситься до найпоширеніших та високотехнічних методів детекції і на сьогодні є основним методом аналізу рослинного матеріалу на наявність генетично модифікованих інгредієнтів. За допомогою ПЛР можна детектувати будь-яку частину впровадженої генетичної конструкції: промотор, структурний ген, термінатор або репортерний ген. ПЛР можна використовувати для рутинного скринінгу ГМО, оскільки відомо, що у більшості конструкцій, які застосовували для генетичної трансформації рослин, присутні або 35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, або елемент регуляції транскрипції (термінатор) гена нопалінсинтетази з А. tumefaciens (pNOS i tNOS).

Проведення ПЛР аналізу з праймерами до згаданого промотора та термінатора дозволяє детектувати переважну більшість трансгенних рослин. Ідентифікація ГМ рослин потребує повної інформації про структуру впровадженої генетичної конструкції та її аналізу. Аналіз матеріалу на наявність генетичних модифікацій за допомогою цього методу поділяється на кілька етапів:

1. Детекція, загальне визначення присутності ГМО в зразках.

2. При наявності позитивного результату наступний етап включає оцінку типу впровадженої генетичної конструкції та, відповідно, визначення наявності дозволу на реалізацію даного типу генетично модифікованих організмів.

3. Кількісне визначення ГМ організмів.

На першому етапі ПЛР відбувається теплова денатурація ДНК при 93-95°С протягом 1 хв. Крім матриці ДНК суміш містить у надлишку пару праймерів, Таq-полімеразу та чотири дезоксирибонуклеотиди. Температуру суміші повільно знижують, до 55°С, що призводить до зв'язування праймерів з комплементарними послідовностями ДНК. Після цього температуру суміші підвищують до 75°С, величини, оптимальної для Таq-полімерази. Починається синтез комплементарного ланцюга ДНК що ініціюється 3'-гідроксильною групою праймера. Внаслідок багаторазового повторення цих трьох етапів відбувається синтез конкретного сегмента ДНК.

Коли кількість копій ділянки аналізованої ДНК становить мільйон та більше, їх можна аналізувати із застосуванням фізичних методів з УФ або флуоресцентним детектуванням. Інформація про наявність ГМО у зразках отримують визначенням присутності або відсутності конкретного амплікону після проведення гель-електрофорезу продуктів НЛР.

Рис. 3.Схема синтезу конкретного сегмента ДНК методо ПЛР

Real-time ПЛР

Найпоширенішим методом кількісної оцінки ГМО є метод полімеразної ланцюгової реакції в умовах реального часу (real-time ПЛР) - методика, що базується на постійному моніторингу продуктів ампліфікації. Даний варіант ПЛР дозволяє проводити коректну оцінку нуклеотидного матеріалу (кількість копій геномних еквівалентів вихідної матриці) в будь-який момент часу протягом всього процесу проведення ПЛР аналізу.

Використання методики real-time ПЛР дозволяє:

1. Визначати вихід продукту реакції після кожного циклу ампліфкацїї.

2. Конструювати згідно з отриманими даними кінетичну криву ПЛР.

3. Визначати відносну концентрацію субстрату на основі аналізу цієї кривої.

Для детекції продуктів ампліфікації використовують флуоресцентні барвники, які забезпечують флуоресценцію, прямо пропорційну кількості ПЛР- продукту.

Рис. 4. Принципова схема проведення експерименту з real-time ПЛР