Вирусты инфекцияларды лабораторлы диагностикасыны принциптері Зерттеу дістері.

Вирусологиялы зерттеу дісі 2 кезенен трады:

А) клиникалы материалдан вирустарды бліп шыару.

Б) блінген вирустарды трлерін анытау немесе салыстыру.

Вирусты анытау шін алынатын зерттеу материалы ртрлі болады, ол инфекциялы процесті динамикасына жне вирусты тропизміне байланысты. Мысалы: тмау немесе шы болса жтыншатан блінетін шырыш, везикуладан ырып алынан материал, жлын сйыы, ЖИТС инфекциясында Т-лимфоциттерді субпопуляциясы, ан сарысуы, сперма; тыру ауруында заымдалан адамны сілекейі жне лгендерді ми тіндері, сілекейдегі блінділері зерттеледі.

Вирусты анытау масатында патологиялы материалмен сезімтал лабораториялы жануарларды, тауы эмбриондарын жне торша сіндісіне жтырады: Мысалы: тмау инфекциясында вирус бар материалды торша сіндісіне егіп немесе кзендер мен тышандарды мрын уысы арылы жтыруа болады. Ол тауы эмбрионыны аллантоис немесе амнион уыстарына енгізу арылы жтыруы е тиімдісі. ЖИТС кезінде тек ана торша сіндісіні яни Т-хелпер пайдаланылады. Вирус лимфоциттер жне макрофагтар сирек олданылады, бл торшаларды ішінде вирус репродукциясыны активтілігі тмен; шы инфекциясы кезінде вирусты сіру шін торша сіндісі немесе лабораториялы жануарлар олданылады. й оянын жне тышандарды тыру инфекциясын длелдеу шін де олданылады.

Вирусологиялы зерттеуде біркелкі жануарларды пайдаланан дрыс. йткені оларды генотиптік жне фенотиптік асиеттері сас инфекцияа те сезімтал.

Патологиялы материалда вирус болан кезде жануарларда инфекциялы ауруларды клиникалы белгілері мен згерістері пайда болады. Мысалы: шы инфекциясымен рса ішіне заымдалан тышандар 3-4 кннен кейін леді. Егер материалды й ояныны немесе теіз шошысыны кзіні млдір абатына жтырса, онда абыну процесі – кератоконьюктивит пайда болады. тыру вирусымен заымдалан тышандарды ая-олдары жансызданады да леді. Тауы эмбрионыны абытарын, аллантоис, амнион уыстарында вирусты кбейгенінен эмбрион тымы заымданып одан рі суі тотатылады. Заымдалан эмбрионда мынадай згерістер байалады:

  1. а датар – хорион-аллантоисты абытаы тмпешіктерді пішіні мен млшері згереді (тмау, шешек вирустары), амнион абыында патоморфологиялы згерістер жне эмбрионны луі.
  2. кзге крінетін згерістер болмаса вирусты анытау шін тауы эмбрионыны аллантоис немесе амнион уыстарыны сйыымен гемагглютинация реакциясы –РГА ойылады. Кбінесе ажырасан аллантоис уысындаы сйытара бірдей клемде 1% тауы эритроциттері осылады. Аллантоис уысындаы сйытаы вирустар серімен байланысты эритроциттерді агглютинациясы микропланшеттер лункасыны тбінде «ол шатыр (зонтик)» трізді аныталады. Агглютинация жо кезде – эритроциттер лунка тбінде – «тйме» трізді орналасады.

Торша сіндісіндегі патоморфологиялы згерістері мынадай: вирустар репродукциясы ядроны немесе цитоплазманы рылымдарын заымдап згертеді немесе торшаны жансыздандырады. Сондытан, микроскоп арылы вирус заымданан торшада мына згерістерді анытауа болады:

  1. Торша ішіне тн патоморфологиялы згерістер. Мысала, тыру ауруында нейрондарды цитоплазмасында Бабеш-Негри денешіктері аныталады, шешек ауруында – кзді млдір абыыны эпителиальды торшаларыны цитоплазмасында – Гварниери денелері, аденовирусты жне шы инфекцияларында заымдалан торшаларды ядросында осындылар аныталады. Бл осындылар вирус бліктері жинаталуы немесе оны компоненттеріні торша материалдарымен жиналуы;
  2. вирусты цитопатиялы серінен торшаны ісінуі, солуы немесе торшаны дегенеративті згеруі абыыны деструкциясымен байалады. лген торшалар адгезивтік асиетінен айырылып шыныны бетінен тсіп алады. Сондытан бір абатты торша сіндісінде біркелкі торшаларды арасында «аладар» немесе бос орындар крінеді. Симпластар (синцитий) – кп ядролы аз мір сретін торшалар вирустарды цитопатиялы серіні ерекше белгісі деп саналады, олар ЖИТС, ызылша инфекцияларына тн.
  3. заымдалан торша ішіндегі вирустар гемадсорбция – Ргадс реакциясы арылы аныталады. Вирусты компоненттер, оны ішінде эритроциттерді агглютинациялайтын гемагглютининдер заымдалан торшаны мембранасына бекінеді. Сондытан вирустармен заымдалан торшалы суспензияа осылан эритроциттерді 1% оспасы торша мембранасына адсорбцияланады. Мндай былыс тмау, ызылша, шешек, аденовирусты жне баса инфекцияларда байалады. Вирустармен заымдалан торшаларды гемадсорбциялы асиеті цитопатиялы згерістерден брын пайда болады, сондытангемадсорбция реакциясын вирусты ерте анытау шін пайдалануа болады:
  4. бляшкалар дісі, бл вирусты цитопатиялы серін байау модификациясы. Вирус серімен байланысты бір абатты торша сіндісіні дгелек сияты бліншегін бляшкалар деп атайды. Бл дісте бір абатты торшаларды вирустарды аз концентрациясымен заымдайды жне торша бетіндегі вирусты блшектерін агармен статады (фиксация), ал агара витальді бояыш – нейтральды ызыл осылан. Бл жадайда вирустарды цитопатиялы сері бір жерге топталан, ал лген торшалар бояуды стау асиетін жоалтып тссізденеді. Соны серінен бір абатты торшаларды млдір емес ызылт фонында айын бляшкалар пайда болады. Олар млдір, тссіз дгелек таба сияты болады. Полимиелит, шешек, ызылша жне баса да инфекцияларды анытау шін осы діс олданылады:
  5. трлі-тсті сынама тіндік торшаларды сіру шін олданылады Игла, 199 орталар рамында оректік заттармен атар индикатор – фенолрот болады, егер рН-7,4-7,6 дрежесінде болса ызыл тсті береді. оректік ортада лайып кбейген торшалар зат алмасуы нтижесінде ышыл заттарды бліп шыарады. Бл себептен оректік ортаны рН 6,9-7,0 дейін тмендегеннен кейін индикаторды яни оректік ортаны тсі ызылдан сарыа згереді. Егер оректік ортадаы торша сіндісі жне вирус – райтын материал бір мезгілде кіргізілсе вирустар торшаны заымдап, дегенеративтік згеріс туызады немесе торшалар жансызданады. Сондытан метоболиттік процестер тоталып рН згермейді жне орта тсі ызыл болып алады, яни трлі-тсті сынама нтижелі болды деп саналады.

Салыстыру (идентификация)

Вирус трін салыстырып анытау жолы лаборатория жануарларында нейтралдау реакциясы арылы жреді, біра бл діс сирек олданылады. Бл шін экспериментальді жануар азасына зерттелетін вирус жне вирус нейтралдайтын антиденелер бар трлі спецификалы сарысу оспасы ртрлі дісімен енгізеді. Егер жануарлар ауырмаса, онда вирустарды антиденелермен нейтралдауын байатады. Белгілі спецификалы антиденелер арылы вирусты типі аныталады.

Вирусты нозологиялы тндігі, тауы эмбрионында блінген жне РГА реакциясында білінген гемагглютинацияны тежеу реакциясымен (РГТА) аныталады. Гемагглютининдерді эритроциттерді агглютинациялау асиетіне РГА реакциясы негізделген. Біра вирусты, рамында вируса бекітілген белоктарды нейтралдайтын антиденелер бар иммунды сарысуымен алдын-ала осып, кейін эритроциттерді осса гемагглютинация реакциясы байалмайды – эритроциттер «тйме» трізденіп шыр тбіне тнады. Бл жадай гемагглютинацияны тежеу реакциясын (РТГА) нтижелі деп саналады. РГА – бл физика-химиялы реакция, ал РТГА – иммунологиялы реакцияны бір трі – нейтралдау реакциясы. РТГА реакциясын тек ана вирусты трін анытаанда емес, сондай-а вирус спецификалы антиденелерді жне оларды титрін ан сарысуында айындауа олданылады.

Нейтралдау реакциясы торша сіндісіндегі вирусты идентификациясын ткізгенде олданылады:

1. нейтралдау реакциясында трлі-тсті сынама олданылады. Трлі-тсті сынаманы ткізу шін белгілі компонент – торша сіндісіне (Игла немесе 199 оректік орта) жне вирусты материал тріне спецификалы сарысу олданылады. Вирусты бліктері антиденелермен нейтралданса бл реакция нтижелі деп саналады. Тіндік торшалар вирустармен заымданбай мір сруге бейім алпында алса, оларды зат алмасуынан ышыл заттар пайда болады. Сондытан оректік ортада рН тмендейді жне оны ызыл тсі сарыа ауысады:

2. цитопатиялы серге байланысты нейтралдау реакциясы. Реакция компоненттері: бір абатты торша сіндісі, вирус райтын материал жне белгілі трге спецификалы сарысу. Вирусты антигендер антиденелермен нейтрализациялаанда тіндік торшалары бзылмай алады. Сондытан, микроскопта цитопатиялы згеріс жо, мндай реакция нтижелі деп саналады.

3. вирустарда «бляшка» дісімен састыру жне оларды анытау. Бл діс цитопатиялы серлі нейтрализация реакциясыны модификациясы болып табылады. Реакция нтижелі боланда – дегенеративтік згерістер – бляшкалар бір абатты торшаларда болмайды:

4. гемадсорбцияны тежеу реакциясында вирус нейтралдау антиденелер арылы вирус трлерін аныауа болады. Егер бір абатты торшалара зерттелетін вирус райтын материалды жне белгілі трге спецификалы сарысу енгізгеннен кейін осылан эритроциттер тіндік торшалар бетіне адсорбцияланбаса, онда реакция нтижелі деп саналады. Себебі, антиденелер вирусты бліктерді нейтралдайды, тіндік торшалар заымдалмайды жне оларды сырты мембранасында вирусты гемагглютининдер жо. Сондытан эритроциттер тіндік торшаларды мембранасында жиналмайды, гемадсорбция тежеледі. Теріс реакция кезінде антигендермен антиденелерді сйкестігі болмаанда вирустар тіндік сіндіні заымдайды, торшалы мембранаа гемагглютининдер бекітіліп эритроциттер торша маына жиналады.

Серологиялы зерттеу кезінде антиденелерді титрін анытау шін сыратты ан сарысуы екі рет 7-10 кн аралыында айталап тексереді. айталап ан сарысуын зерттеуді ажеттілігі мынау: Вируса арсы антиденелерді титрі бірінші рет зерттелген анда вакцинация немесе ертеде болан жпалы аурумен байланысты болуы ммкін. Егер инфекция динамикасында антиденелерді титрі жоарыласа ол айтарлытай длел. Антиденелерді титрін 4 есе жоарылааны вирусты инфекцияны длелдейді.

Серологиялы зерттеу жабдытары: 1. зерттелетін ан сарысуы, яни онда вирус нейтралдайтын антиденелерді анытау; 2. белгілі вирус спецификалы антигендер немесе вирус бліктері; 3. бл биологиялы обьект одан жоарыда крсеткен зерттелетін ан сарысуыны жне белгілі вирус бліктеріні зара атынасуын, яни нейтрализация реакциясыны нтижесін креміз. Обьект ретінде лабораториялы жануарлар, тауы эмбриондары жне торша сінділері болуы ммкін. О реакция кезінде трге спецификалы антиденелер, зерттелетін ан сарысуындаы вирустарды нейтралдайды, сондытан:

1. лабораториялы жануарлар ауырмайды, рі лмейді.

2. тауы эмбриондары да патологиялы згеріссіз болмайды;

3. бір абатты торша сіндісінде ЦП, бляшкалар, гемадсорбция байалмайды. Торша тіндік сіндісінде интактілі болып алады. Трлі-тсті сынама торша суспензиясыны мір сру бейімділігін длелдейді (оректік ортаны тсі сары), зерттелген сарысуда табылан антиденелер вирустарды нейтралдайды.

Экспресс-диагностика. Бл діс клиникалы материалды аланнан кейін бірнеше саат арасында жауап алуа ммкіндік береді. Аурулардан алынан материалдан вирусты анытауа болады. Экспресс дісті негізі - клиникалы материалды зерттеу. Науастан алынан материалдаы (ан, шырышты абыты жаындысы, лкен жне кіші дрет) вирустарды сезімтал биологиялы жйелер арылы (торша сіндісі, тайы эмбрионы, лабораториялы жануарлар) сіріп кбейтуді ажеті жо.

1. Электронды-микроскопиялы зерттеу (ЭМ). Бл дісті детті тсілдермен сіруге келмейтін (коронавирустар, ротавирустар, А жне В гепатит вирустары) немесе типтік морфологиядаы (шешек вирусы) вирустарды анытаан кезде ерекше баалы. ЭМ пайдалануы мынадай жадайлармен шектеледі, егер клиникалы материалда вирус блшектеріні концентрациясы 104-105 мл кем болмау керек. сас вирустарды ажыратып анытауа электронды-микроскопиялы діс олданылмайды.

2. Иммунды электронды-микроскопиялы діс (ИЭМ). Вирус блшектерімен антиденелерді байланысанында иммунды комплекстер пайда болады. Оларды центрифуга арылы тнбаа тсіреді. Электронды-микроскоппен зерттегенде вирустарды жиынтыы крінеді, ал антиденелер айын крініп трмаан со байалмайды. Белгілі трге спецификалы антиденелер арылы иммунды комплекстегі вирустарды анытауа болады.

3. Жарыты микроскоппен зерттеу. Бл діс басалар мен салыстыранда сирек олданады. Ірі шешек вирусын Морозов дісімен боялан микропрепаратта круге болады. Бл діспен Романовскии-Гимзе жне баса дістермен боялан гиспопрепаратты клетка ішіндегі осындылар аныталады. Мысалы: заымдалан нейрондарда Бабеш-Негри денешіктерін осы дістермен бояанда байалады.

4. Иммунофлюоресценция реакциясы – РИФ кптеген вирус инфекцияларыны экспресс-диагностикасыны бірден бір дісі. Себебі, люминесцентті микроскопты ке олдануы, реакция техникасыны иын еместігі, дісті жоары сезімталдыы. РИФ немесе Кунс реакциясыны негізін флюоресцентиоционат (ФИТЦ) немесе баса флюорохромдарды антиденелерімен химиялы комплекс байланысуы, ФИТЦ-пен химиялы байланысан антиденелер (иммунды сарысуларды рамында) иммунологиялы ерекшелігін сатайды жне белгілі антигендермен зара байланыса тседі. Антигендер мен антиденелерді комплекстерін микропрепаратты сары-жасыл жары арылы люминесценттік микроскоппен те оай анытауа болады.

А) иммунофлюоресценцияны тзу реакциясы – зерттелген антигендерге арсы иммунофлюоресценттік сарысулар пайдаланылады

Б) РИФ тзу емес реакциясы – екі трлі сарысулар пайдалануа негізделген. Басында зерттелетін антигенге арсы флюоресценттік емес антиденелер олданады, ал реакцияны екінші кезеінде пайда болан антиген – антиденелер комплексін ФИТЦ-пен байланысан антисары су осылады. Бл ФИТЦ-пен байланысан сарысу (трге арсы сарысу) рамында реакцияны бірінші кезеінде олданан флюоресценттік емес антиденелерге немесе гамма-глобулиндерге арсы анти-антиденелер болады.

Егер, РИФ бірінші кезеінде олданан антисары су ойлардан иммунизация арылы алынса, екінші кезеінде олданатын трге арсы сарысу дайындау шін ойды гаммаглобулиндерімен баса трді ажыратады (й ояны, есек жне т.б.) иммунизациялайды. Трге арсы сарысу рамындаы антиденелер ФИТЦ-пен химиялы байланысан. Сонымен зерттелген антигендерді екінші абатпен антиглобулиндер жабады (бірінші абат - флюоресценттік емес антиденелер, олар антиглобулиндері бар сарысуа антиген ретінде болады). Реакция нтижесінде люминесценттік микроскопта антиген-антидене-анти-антиденелер комплекстері крінеді. Егер иммунофлюоресценцияны тзу реакциясында рбір вирус антигендеріне арсы дереу антисарысуларды ФИТЦ-пен химиялы байланыстыру керек болса, ал тзу емес реакциясында флюорохром тек трге арсы сарысумен байланысан.

А) реакцияны тзу варианты. Мысала, респираторлы вирус инфекциясында вируспен заымдалан торшаларды назофарингиальді секреттен алуа болады. Назофарингиальді секреттегі торшаларды сйытан бліп алып фосфатты буферлі ерітіндімен шаяды. Торша тнбасына фосфатты буферлі ерітіндісіні бірнеше тамшысы осылады содан 3-4 жын-препаратты дайындайды. Жындыларды ауада кептіреді рі ацетонмен бекітеді. ФИТЦ-пен бекітілген рамында вируса арсы антиденелер бар сарысуды жмысты ерітіндісімен препаратты бояйды. Термостатта 30мин. экспозициядан кейін препаратты 3 рет фуцермен, содан со бір рет дистилденген сумен шаяды. Препарат люминесцентті микроскоппен зерттеледі. О реакцияда препарат сары-жасылмен жарырайды, теріс реакцияда жарырамайды.

Б) тзу емес реакция варианты. Дайындалан жына рамында вирустара арсы антиденелері бар сарысу тамызады, 30 мин со экспозиция, ФБР-мен жне дистилденген сумен шаяды, оны стіне ФИТЦ-пен байланысан антисарысу тамызады.

  1. Иммуноферментті анализ – ИФА, антигендер мен спецификалы антиденелерді атынасына негізделген. Реакцияда ферменттермен белгіленген вирустара арсы немесе трге арсы антиденелер пайдаланылады. Антигендер жне ферменттер байланысан антиденелер комплекстері спецификалы субстрат (хромоген) арылы аныталады. Тссіз хромоген ферментпен байланысып бояулы жадайда теді.

Антигендер+ антиденелер (фермент)+ хромоген= бояу.

Антигендер+ антиденелер комплекстеріні саны материалды боялуыны дрежесіне тура пропорциональді.

Реакцияны бірінші компоненті – антиген, атты фазаа тнады. Полистирольды пластинкаларды тегіс тбін атты фаза деп атайды. Арнайы буфер ерітінділерді инкубациялаанда антиген электростатикалы кш серімен атты фазаа адсорбцияланады.

Пероксидаза, сілтілі фосфатаза, цитохром С жне баса ферменттер антиденелерді белгілеу шін пайдаланылады. Ферменттер байланыстын субстрат ретінде хромогендер – ортофенилендиамин, ортотолуидин, бензидин жне баса трлері олданылады.

ИФА дістеріні ішінде тзу жне тзу емес РИФреакцияларына сас варианттар жиі пайдаланылады.

ИФА-ны тура вариантында белгісіз зерттелетін антигендерге арсы ферментпен байланысан антиденелер олданылады:

зерттелетін антигендер+ антиденелер(фермент)+ хромоген.

ИФА-ны тзу емес вариантында, керісінше, белгілі антигендер, белгілі ферментпен байланысан трге арсы сарысу жне зерттелетін сарысу (бдан вирус нейтралдау антиденелер аныталады);

Белгілі анти- науасты зерттелетін ферментпен белгіленген гендер + сарысуы + иммуноглобулиндеріне + хромоген арсы антиденелер (трге арсы антиденелер)

ЖИТС диагностикасында олданылатын ИФА-ны техникасы (тзу емес вариант);

Реакция компоненттері:

  1. ауруды зерттелетін сарысу
  2. полистиролды микропланшеттер, оларды шырларында алдын-ала вирусты антигендер адсорбцияланан.
  3. пероксидазамен белгіленген антиглобулинды (трге арсы) сарысу рамында АИВ-ге арсы антиденелер бар жне рамында АИВ-ке арсы антиденелері жо сарысулар.
  4. ортофенилдиамин
  5. фосфатты буферлі ерітінділер, твин-20 – шырды шаю шін керек.

Реакция ткізу техникасы:

  1. Полистиролды микропланшетті шырларына ауруды зерттелетін сарысуы йылады. Экспозиция 1-2 саат 370С.
  2. Иммунологиялы реакцияда байланыспаан зерттелетін сарысудаы антиденелерден шырларды шайып алу.
  3. Пероксидазамен байланысан адамны гаммаглобулиндеріне арсы, трге арсы сарысу рамындаы антиденелерді енгізу.

Экспозиция 2 саат 370С.

  1. Байланыспаан конъюгатты шаю.
  2. Ортофенилді ерітіндісін енгізу, инкубация 30 мин. араыда, 18-200С. Инкубация процесі кезінде пероксидазаны химиялы серінен ортофенилдиамин оыр тске боялады.

Нтижесі о сарысу осылан ерітінді осы сияты болады.

Нтижесі теріс сарысу осылан ерітінді боялмайды.

6. РИА – радиоиммунды анализ. Антиденелерді, антигендерді радиоактивтік изотоптармен табалайды (йод131, 135, сутегі – Н3, кміртегі – С14). Радиоактивті табалы антигендер-антиденелер комплекстері арнайы радиоактивті есептегіш арылы аныталады. Клиникалы сыната зерттелетін антигендерді немесе антиденелерді млшері радиоактивтікке тура пропорцианальді. Радиоиммунды анализді РИФ-пен салыстыранда жоары, ал ИФА реакциясымен те тседі. Ал бл реакцияны (РИА) кемшілігі белгіленген компоненттерді трасыздыы, биологиялы ауіптілігіне жне радиоактивті есептегіш олдану керектігіне байланысты.

Иллюстративті материал