Вирусты сіру тсілі

1.Вирустарды суі мен блінуіні бірден-бір тсілі лабораториялы жануарларды заымдау болып саналады. Жаа туан жануарлар жиі пайдаланылады, себебі олар сезімтал келеді. Тжірибелік жануарларды срыптау кезінде вирустара оларды сезімталдыы мен абылдаыштыына кіл аудару керек. тыру вирусымен тышандар, й ояндарызаымданады, ал, тмау вирусымен тышандар жне кзендер заымдалынады. Вирусы бар материалды жануарлара егу (тері асты, блшы етке, венаа, миа, мрын уысы арылы) жолы жануарлардытрі мен вирустарды тропизміне байланысты.

2.Сырты ортаны обьектілерінен жне аурулардан алынан вирустарды сіру шін тауы

эмбрионы кеінен олданылады жне осы жолмен сірілген вирустардан вакциналарды

дайындау, диагноз оюа диагностикумдарды дайындау, вирустарды трін анытау шін

ажет.

Адам жне жануарларда заым келтіретін, кптеген вирустар кп немесе аз млшерде тауы эмбрионында кбейе алатындыы аныталан. Эмбрионны тыыз сырты абаты сырты ортадан тсетін микроорганизмдерден орайды, сондытан вирустар стерильді жадайда кбейеді. Вирустарды сіру шін 4-12 туліктік эмбриондар пайдаланылады. Мысалы: тмау вирусын бліп алу шін 11 туліктік эмбрионды олданылады.

мір сру абілеті бар эмбриондарды жмыса іріктеп алу шін оларды овоскоппен зерттейді. Жары ткен абыты ішінде эмбрион, хорионалантоисты абыты ауа уысыны шекарасы крінеді. мір сргіштік абілеті бар эмбриондар жылжымалы, абыршытарыны тамырлары анмен толтырылан.

Вирусы бар материалды алантоисты уыса (тмау, шы, шешек вирустары), амнион уысына (тмау вирусы), сары апшыа (тыру, шы вирустары), хорион-алантоисты абыршытара (тмау, шешек вирустары) енгізіледі. Хорион-алантоисты абыты вирустарды кбейту шін олдану ке тараан дістерді бірі болып табылады. Оны негізгі себебі, кптеген вирустар осы абыта кбеюі белгілі бір морфологиялы згерістерге тседі. Кбінесе тмпешік (бляшка) трізді ашыл датар пайда болады.

Вирустарды торша сіндісінде сіру.

Вирустарды сіру шін клетка культурасы пайдаланылады. Кптеген вирустар здері кбею шін сезімталдыы жоары кульдураларды тадап алатын боландытан, клетка культурасы универсальды культура болып табылады. Адамны, тауыты, ойды, сиырды теіз шошасыны, а тышандарды трипсинденген эмбриональды клеткалары жне ересек маймылдарды бйрек клеткасы жиі олданылады. Сондай-а атерлі ісік клеткаларыны культурасы пайдаланылады. Трипсиндеуді негізі, протеолитикалы ферменттерді (трипсин, хемотрипсин т.б.) лсіз ерітінділері арылы клетка аралы байланысты зе отырып, клеткаларды мір сру абілетін сатап алуы болады.

Клеткадаы вирустарды цитопатикалы серіні байалуы заымдалан клеткадаы вирустарды бар екендігін анытау шін те олайлы.

Клетка культурасы баса тсілдерге араанда, вирустарды суіне біркелкі жадай туызады, йткені клеткалар бір тканьге жатады. асиеттері сас жне арасында антиденелер, ерекшелігі жо тежеушілер болмайды.

Клетка жзгіні inviro тіршілігін сатау шін рамы крделі оректік орта (Игла, 199 ортасы) жне тзды ерітінділер (Хенкса, Эрла ерітіндісі, Тироде сйыы) олданылады. оректік орта клетка культурасыны суін жне кбеюін амтамассыз етеді, ал тзды ерітінді клетканы тек ана тіршілігін сатауа ажет. Бактериялармен ластанудан сатау шін (сіресе микоплазмадан) су ортасына антибиотиктер осылады.

Клеткалар культурасыны тмендегідей жіктелуі олданылады:

А) тіршілігін сатайтын тіндерді культурасы

Б) суші тіндерді культурасы, оларды зі:

1.айындалан тіндер блігіні культурасы – тінні саталан блімі тауы плазмасымен араластырылады, пайда болан ою бліктерді бекітеді.

2.суспензияланан клетка культурасы – клетка суспензиясы немі магниттелген араластырышпен немесе барабанмен, болмаса арнайы реактормен араластырып трады.

3. бір абатты клетка культурасы. Клетка сері алдында шыныны бетіне бекітіледі

(пробирканы, матрацты абыраларына) содан кейін алыдыы бір клеткадай абат рал

седі, соны арасында болып жатан згерістерді байауа болады. Бірыай абат культу

радан біркелкі мір сргіштігі жасы кп дрежелі клеткалар алуа болады.

  Вирусологиялы зерттеулер дістері   Жоспары: 1. Вирусологиялы дістері 2. Серологиялы (иммунологиялы) дістері 3. Молекулалы-генетикалылы дістері   Барлы олданылатын вирусологиялы зерттеу дістерін шартты трде ш топа блуге болады: - вирусологиялы зерттеулер – зерттелетін заттан вирусты бліп алып, содан со идентификациялауа негізделген; - серологиялы зерттеу дістері иммунологиялы реакциялара негізделген. Вирустарды серінен организмде болатын спецификалы (арнайы) згерістерді анытау, яни ан сарысуындаы арнайы антиденелерді анытау. - молекулалы-генетикалы зерттеулер - вирусты нуклеин ышылын гибридизациялау немесе полимеразалы тізбектелу реакциясы кмегімен биологиялы материалдаы нуклеин ышылдарыны фрагменттерін табу. Вирусологиялы дістерді негізі – оздырушыларды заымдалан материалдан бліп алу. Ол шін оздырушыны арнайы тірі объектілерге егеді: лабораториялы жануарлара, тауы эмбриондарына, жасуша даылдарында сіріп-кбейтеді. Тжірибеде біріншілік, жартылай ауыспалы (диплоидные или полуперевиваемые) жне ауыспалы (перевиваемые) жасуша даылдарын пайдаланады. Вирустарды жасуша даылдары арылы бліп алу. Бл те арзан діс. Кп вирустарды трін анытау шін (парагриппті 3 серотрін, аденовирустарды) жасушалар даылдарын олданады. Жасуша даылдарында вирусты сіп-кбею белгісі ретінде вирусты цитопагендік сері болып табылады. Вирустар жасушаны згертеді: жасуша дгелектеніп заымданады. Заымданан жасуша еріп жоалып кетеді. Оны орнына симпласт пайда болады. Вирустарды тауы эмбриондары арылы бліп алу. Эмбриондарды олдананда кндік жасымен (6-15 кндік) жтыру жолыны маызы бар. Сонымен бірге, тауы эмбриондарында жасырын вирусты бар-жоын ескерту ажет. Себебі вирусы бар эмбрион ауруды дрыс анытауа кедергі жасайды немесе интерференция болуы ммкін. Сондытан, эмбриондарды таза с фабрикасынан немесе оларды егілмеген тауытардан алады. Вируспен заымдалан материалды шприцпен хорион аллантоисты абатына (ХА), сарыуыз апшыына, амнион жне аллантоис уыстарына енгізеді. Эмбриондарды горизонталды жадайда термостатта (35-370 С) 48-72 саат инкубациялайды. Тауы эмбрионында вирустар сіп-нген кезде ХА-та тиісті згерістер пайда болады. Шешек вирустары ХА-да тймешектер тзеді – диаметрі 1-3 мм ашылдау дес датар. Вирусты бліп алан со оны трін анытау, яни идентификация жргізу шін серологиялы реакциялар олданады. Мысалы, гемагглютинациялы реакция (ГАР) – жтырылан эмбриондарды аллантоисты немесе амнионды сйытытарында тауы немесе баса жануарларды эритроциттеріні гемагглютинациялануы орто- жне парамиксовирустарды сіп-ніп жиналанын крсетеді. Осындай вирустарды беткейлік рылымдаы табиаты гликлпротеидті гемагглютининдері эритроциттерді агглютинациялайды. Гемагглютинациялы реакция (ГАР) иммунологиялы реакцияа жатпайды, йткені иммунды комплекс тзетін антиген мен антиденені зара рекеттесуі болмайды. Серологиялы дістер кбінесе вирусты антигенімен гомологиялы антиденені зара рекеттесу реакцияларына негізделген. Мысалы, сйы ортада - комплемент байланыстыру реакциясы (КБР-РСК); гельде - радиальды гемолиз реакциясы (РГР); ингредиенттерді біреуін тыыз негізге фиксациялау кезінде - иммунды флюоресценциялы реакция (ИФР), иммунды-ферментті талдау (ИФТ). азіргі кезде р трлі тсілдермен табаланан АД немесе АГ атысуымен ойылатын серологиялы реакциялар ке олданылады. Мндай реакциялар нтижені жылдам алуа ммкіндік береді жне оларды сезімталдыы те жоары. Сондытан, вирусты жне бактериялы инфекциялар кезінде жылдам диагноз ою шін жиі олданылады. Табалауды ке таралан тсілдеріне жатады: 1) ультраклгінмен сулелендірген кезде флюоресценция беру абілеттілігі бар флюохромдар жне лантанйод тобына жататын металдар, мысалы флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ); осындай табалау ИФР-да пайдаланылады; 2) ферритин-ауыз, рамында 23%-а дейін темір бар, ол жасы контраст береді, сондытан иммунды-электронды микроскопиялау кезінде табалау шін олданылады; 3) ферменттер-субстратпен зара рекеттескен кезде оны ыдыратып, боялан (хромогендік) німдер тдырады, ИФТ-иммунды-ферментті талдау шін пайдаланады; 4) радиактивті табалау, те сезімтал РИТ-радиоиммунологиялы талдау реакцияларында олданылады. Иммунды флуоресценциялы реакция (ИФР) – ИФР АД-мен химиялы байланысан флюоресцеинизотиоцианатты немесе баса флюорохромдарды пайдалануа негізделген. Бл кезде табаланан АД иммунологиялы спкцификалыын сатайды жне тиісті корпускулярлы АГ-мен зара рекеттесуге тседі. Люминисцентты микроскопта препаратты зерттегенде жасыл-сары тспен жарырап крінуіне арай АД мен АГ-кешенін оай анытауа болады. ИФР-ны екі трі бар: тте (прямая) жне жанама (непрямая). Молекулалы-генетикалы дістер оздырышты нуклеин ышылыны молекуласын табуа ммкіндік береді. Оларды спецификалыы организм геномдарыны, яни ДН жне РН- нуклеотидтік реттілігіні тек ана зіне тн екендігімен байланысты жне комплементарлы принципке – нуклеотидтік осаты (А-Т, Г-Ц) бір-біріне сйкестігіне негізделген. Ол Н- сас фрагменттерімен (соны ішінде эталонды жне ізделетін фрагменттермен) гибридизациялауа ммкіндік береді. Полимеразалы тізбектелу реакциясын (ПТР) олдануа байланысты бл діс жоары сезімталдыа ие болды. ПТР спецификалы праймерлерді (бзыш-затравка) – ерекше фермент полимеразаларды кмегімен ДН- тиісті бір блігін циклдік осатауа негізделген. Бірінші циклден кейін ДН- бір фрагментінен екі фрагмент пайда болады, екіншіден кейін – тртеу жне рі арай ДН- саны геометриялы прогрессиямен кбейеді. Е соында зерттелетін лгіде (образец) Н- бір молекуласы болса да ДН- саны жеткілікті млшерде жинаталады да, оларды физикалы-химиялы дістермен – хроматографиямен немесе электрофорезбен оай анытауа болады. осатану (амплификация) басталуы шін оздырыш ДН- тиісті учаскесіне комплементарлы 20-30 аминышылды алдытардан тратын олигонуклеотидті реттілігі (праймер) болуы керек. Праймерлерді ртрлі оздырыштарды белгілі гендеріне сйкестігін сатап, арнайы аппараттарда – синтезаторларда дайындайды. ДН-ын блшектеу – секвенирлеу. Полимеразалы кшірмелеу принціпін пайдаланып, ДН- блшектеу келесі кезедерден трады: 1) ПТР-ді кмегімен ДН- зерттелетін учаскесіні кшірмелерін жеткілікті млшерде жинатайды. 2) Алынан ДН молекулаларын сілтілік гидролиздеумен зындыы ртрлі фрагменттерге кесіп шыады. Мысалы, егерде зындыы 5 нуклеотидтен тратын реттілікті зерттейтін болса, осы этаптан кейін ДН кесіндісіні зындыы 1,2,3,4 жне 5 нуклеотидтен тратын оспа алынады. 3) Алынан оспаа дидезоксинуклеотидтерді (аденин, тимин, гуанин, цитозин) осады. Оларды райсысы зіне тн бояышпен белгіленеді. Табаланан дидезоксинуклеотидтер рбір фрагментті 3/ шетіндегі комплементарлы нуклеотидтерге тіркеледі. Тізбекшені заруы дидезоксинуклеотидтерді химиялы рылысыны ерекшеліктеріне байланысты осымен аяталады. Сонымен, андай нуклеотид оларды 3/ шетіне орналасуына байланысты зындыы ртрлі фрагменттер зіне тн р трлі табалармен белгіленіп алады. 4) ДН- табаланан фрагменттерінен алынан оспа денатурациялануы вертикалды полиакриламидті гель арылы электрофорезден теді. Бл кезде бірінші кезекте молекулалы салмаы е аз фрагмент (мысалы, зындыы 1 нуклеотидке те ДН- тізбекшелері) жылжиды. Оларды барлыы осы нуклеотидке сйкес табаларды таситын болады – реттіліктегі бірінші нуклеотидке. Содан кейін оптикалы крсеткіш (датчик) арылы зындыы 2 нуклеотидтен тратын ДН тізбекшесі теді – оны шетіндегі таба зерттелетін ДН реттілігіндегі екінші нуклеотидке сйкес келеді. Одан рі е зын фрагменттер тіп боланша процесс жаласа береді. Электрофорез аяталан кезде зерттелетін фрагментте нуклеотидті реттілігі айын аныталады.   Нуклеин ышылдарын гибридизациялау. Гибридизация – ол бір тізбекшелі нысана – Н-ны радиоактивті изотоппен немесе ферментпен табаланан комплементарлы молекуласымен – зондпен байланысатын процесс. Зонд ретінде ДН-н жне РН пайдалануа болады. ДН зондтар екі тізбекшелі болатындытан бір тізбекшелі фрагменттер алу шін олданудан брын оларды денатурациялау (мысалы, ыздыру) керек. РН зондтар негізінде бір тізбекшелі молекулалар, олданудан брын оларды денатурациялауды ажеті жо. Зерттелетін материалда детте р трлі нуклеин ышылдары кезедесетіндіктен, зонд е алдымен осындай крделі оспадаы зіне тн комплементарлы «серіктесін» тауып алып, содан кейін ана онымен бірге кешен (комплекс) тзеді. Тжірибеде гибридизацияны бірнеше модификациялары олданылады.