Схема типичного эксперимента по клонированию ДНК. Общие принципы конструирования рекомбинантных молекул ДНК
Клонирование – процесс получения генетически идентичной группы клеток (клонов ), основанный на бесполом размножении одной клетки.
Клонирование – процесс получения генетически идентичной группы клеток (клонов ), основанный на бесполом размножении одной клетки.
Схема типичного эксперимента по клонированию фрагмента ДНК:
1)Получение фрагмента или фрагментов ДНК
2)Конструирование in vitro рекомбинантных молекул (встраивание фрагмента в вектор)
3)Ведение их в клетку
4)Отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу.
Суть конструирования рекомбин. ДНК заключается во встраивание фрагментов ДНК, среди кот. находится интересующий нас участок ДНК, в так называемые векторные мол-лы ДНК (векторы) – плазмид. или вирусные ДНК, кот. могут быть перенесены в клетки про- и эукариот и там автономно реплицироваться. На след. этапе проводится отбор тех клеток, кот. несут в себе рекомбинант. ДНК (с помощью маркерных признаков, кот. обладает сам вектор), и затем индивидуал. клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы специфич. для данного гена или участка ДНК).
Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК:
1 случай. 3’-концы фрагментов ДНК, среди кот. находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3’-концы линейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комплиментарной ей гомополинуклеотидной послед-тью (т.е. поли(а)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплементарного спаривания искусственно полученных «липких» концов.
2 случай. «Липкие» концы создаются с помощью расщеплений мол-л ДНК (как вектор., так и содерж. интересующей нас фрагмент ДНК) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы высоко специфичны. Они «узнают» в ДНК последоват-ть из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров они вносят ограниченное число разрывов.
3 случай. Смесь 1 и 2ого. Когда «липкие» концы ДНК, обр. рестриктазой удлиняются синтетическими последоват-ми.
Концы фрагментов можно превратить в «липкие», наращивая их двутяжевыми олигонуклеотидами («линкерами»), в состав кот. входит участок узнавания рестриктазой. Часто в качестве «линкера» используется полинуклеотидные фрагменты, кот. содержат специф. участки для нескольхих рестриктаз («полилинкер»-сайт множественного клонирования, включает сайты узнавания многих рестриктаз).
После встраивания чужеродной ДНК в вектор, их ковалентное сшивание осущ-тся ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинир. мол-ле больше, чем одна фосфодиэфирная связь, то она встраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарационной системы.
Принцип конструирования рекомбинантных молекул:
79. Понятие о векторах. Требования, предъявляемые к векторам. Векторы клонирования.Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК, способная переносить чужеродную ДНК и обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках. Природными векторами являются многие плазмиды и вирусы (фаги).Вектор должен:1) Автономно реплицироваться в клетках хозяина; 2)иметь селективный маркер (маркеры); 3)иметь уникальный сайт (сайты) клонирования; 4)не утрачивать способности к автономной. репликации в результате инсерции чужеродной ДНК. + доп. Свойства 5) Стабильно поддерживаться в клетках; 6) Быть многокопийным; 7)быть небольшого размера. + Желательно также иметь сайты рестрикции внутри генов устойчивости к антибиотикам (для плазмидных векторов). Векторы классифицируются на две большие группы: по назначению и по происхождению. К первой группе относится векторы общего назначения и специализированные (векторы клонирования, векторы экспрессии, векторы для секвенирования и др.). Ко второй, плазмидые, фаговые (на основе фага λ, на основе однонитевых фагов), + для клеток животных – векторы на основе эукариотических вирусов: ретровирусов, аденовирусов, вируса герпеса.Векторные системы включают в себя: 1)Вектор переноса генов (“челночный вектор”), 2) Вектор амплификации (увеличение числа копий генов)3) Вектор интеграции(включение в хромосому)4) Вектор экспрессии (увеличение активности гена). В технологии рекомбинантных ДНК клонирование – это использование процедур манипулирования ДНК для получения множественных копий гена или фрагмента ДНК. Клонирование достигается с помощью перемещения фрагмента ДНК в векторную молекулу. Поскольку имеет место клонирование в векторе одного фрагмента ДНК, такую технологию называют МОЛЕКУЛЯРНЫМ КЛОНИРОВАНИЕМ.