Количественное определение каталазы крови

3.2.1 Реактивы и оборудование. 1%-ный раствор перекиси водорода, 10%-ный раствор серной кислоты, 0,1 н раствор КМn0₄, дистиллированная вода, кровь, Мерные колбы на 20 мл, конические колбы на 100
мл, пипетки, бюретка, спиртовки или электроплитка.

3.2.3 Ход работы: В мерную колбу на 20мл. налить 10 - 15 мл.
дистиллированной воды, внести 0,02 мл. крови и довести водой до метки
(разбавление 1:10000 - момент разведения отметить на часах). Половину
приготовленного раствора крови прокипятить в течение 2 минут. В две
колбочки отмерить по 7 мл. дистиллированной воды, внести в первую 1 мл.
основного раствора крови (опыт), во вторую - 1 мл. прокипяченной крови
(контроль). Через 30 минут после первого разведения крови прилить в каждую
колбу точно по 2 мл. 1% раствора перекиси водорода и снова оставить на 30
минут. По истечении указанного времени внести в каждую колбу по 5 мл. 10%
раствора серной кислоты для прекращения действия фермента и оттитровать раствором марганцовокислого калия до появления стойкого розового окрашивания. Расчет каталазного числа провести по формуле:

Х = (А - В) * 1,7, где

(А - В) – разность в количестве мл. 0,1 н раствора марганцовокислого калия, израсходованного на титрование контрольной и опытной колб;

1,7- мл перекиси соответствует 1 мл. 0,1 н раствора марганцовокислого калия.

Каталазное число показывает количество мг. Перекиси водорода, разрушенной мл крови.

Сравнить полученные результаты и внести их в таблицу.

Таблица 3. Каталазная активность крови

№ пробирки	Израсходовано мл. КMnO₄	(А - В)	Каталазное число
Контроль А	Опыт В

Качественная реакция на пероксидазу молока.

Пероксидазы образуются во всех клетках тела. Больше она обнаруживается в печени. Легче всего дифференцируеися в молоке. Неактивная пероксидаза синтезируется клетками молочной железы и переходит в молоко.

3.3.1 Реактивы. 0,5% раствор перекиси водорода, раствор йодокалиевого крахмала (в колбу на 200 мл влить немного воды, внести 3 гр. крахмала, хорошо перемешать, поставить на электроплитку и добавить медленно 100 мл кипяченой воды, полученному раствору дают прокипеть, остужают и добавляют 3 гр. йодистого калия растворенного в несколько мл воды), молоко сырое и кипяченое.

3.3.2 Ход работы. В одну пробирку налить 5 мл сырого молока, в другую 5 мл кипяченого молока, добавить по 5 капель раствора перекиси водорода и раствор йодокалиевого крахмала. В пробирке с сырым молоком развивается синее окрашивание.

H₂O₂ + пероксидаза = H₂ O + «О»

Н₂O + O₂КI = 2КОН + I₂

I₂+ крахмал = синее окрашивание

Полученные результаты объяснить и сделать выводы.

Контрольные вопросы

- главная дыхательная цепь клетки и ее ферменты

- характеристика других путей клеточного дыхания

- химическая природа и биологическая роль каталазы и пероксидазы

- энергетический эффект биологического окисления.

Лабораторная работа №4.

«Рефрактометрическое определение общего белка в сыворотке крови. Электрофорез белка»

Показатель общего белка в сыворотке крови имеет видовую специфичность. Его содержание зависит от многих факторов. Все это нашло широкое применение в практике животноводства и др. этот метод наиболее удобен для определения концентрации белка в сыворотке крови, лимфе, экссудатах и др. биологических жидкостях.

4.1 Цель работы. Освоить метод количественного определения белков в сыворотке крови. Разобрать вопрос о роли белков в жизнедеятельности организма.

4.2 Реактивы. Сыворотка крови, дистиллированная вода, спирт для протирания призм.

4.3 Оборудование. Штатив с пробирками, стеклянные палочки, марлевые салфетки, рефрактометр.

4.4 Ход работы. Принцип рефрактометрии заключается в определение коэффициента преломления сыворотки. Показатель преломления сыворотки крови зависит от содержания в ней белковых веществ. Перед началом работ необходимо настроить рефрактометр. Для этого на поверхность измерительной призмы нанести стеклянной палочкой каплю дистиллированной воды и осторожно закрыть верхней призмой. Вращая ручку измерительной головки, совместить границу света и тени с пресечением визирных линий в поле зрения окуляра. Если при этом наблюдается радужная окраска, ее следует устранить вращением дисперсного компенсатора. Затем отсчитать показатель преломления по шкале. Для воды он должен быть равен 1,3333. если этого не наблюдается, то поворотом ручки измерительного блока индекс шкалы установить на показателе преломления 1,3333, а перекрестие нитей навести точно на границу света и тени с помощью специального ключа. Стеклянной палочкой нанести на поверхность сухой призмы 2-3 капли сыворотки крови и быстро закрыть камеру. Совместить границу света и тени с пересечением визирной линии, произвести по шкале отсчет показания преломления сыворотки крови и по величине коэффициента преломления найти в таблице процентное содержание белка.

Полученные результаты оформить в таблицу.

Таблица 18. содержание белка в сыворотке крови.

№ пробы

Показатель преломления

Содержания белка, %

Физиологическая норма, %

4.5 Ознакомиться с устройством прибора для электрофореза, методикой разделения белков в электрическом поле, анализом электрофореграмм.

Контрольные вопросы

- Принцип рефрактометрического метода определения общего белка;

- Сущность метода электрофореза белков и его значение для клиники;

- Норма содержания белков в крови с.х. животных;

- Белки полноценные и неполноценные;

- Фракции белков в сыворотке крови, их характеристики.

Лабораторная работа №5

«Определение содержания неорганического фосфора в сыворотке крови (по С.А. Ивановскому)»

Минеральный обмен в организме с.х. животных важнейшую часть в процессах формирования продуктивных свойств. В качестве основных показателей минерального обмена используют содержание в крови макроэлементов кальций и фосфор. В условиях РБ зачастую имеет место дефицит обеспеченности животных фосфором.

5.1 Цель работы. Освоить один из методов количественного определения фосфора в сыворотке крови, разобрать вопрос о значении минерального веществ для организма с.х. животных и птицы.

5.2 Реактивы. 20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 1% раствор аскорбиновой кислоты на 0,1нрастворе HCI, стандартный раствор фосфора, 5% раствор молибденовокислого аммония на 15% растворе серной кислоты, дистиллированная вода, сыворотка крови.

5.3 Оборудование. Штатив с обычными и мерными пробирками, пипетки, обеззоленные фильтры, фотоэлектроколориметр.

5.4 Ход работы. В пробирку налить 3 мл. дистиллированной воды, 1 мл. исследуемой сыворотки крови, 2 мл. раствора ТХУ и отфильтровать в мерную пробирку. Набравь 2,5 мл. фильтра, добавить 1 мл. молибдата аммония, 1 мл. аскорбиновой кислоты и довести водой до 10 мл. одновременно в другой пробирке поставить контрольный опыт, для чего внести в нее 3 мл. стандартного раствора фосфора. 1 мл. молибдата аммония, 1 мл. аскорбиновой кислоты и 5 мл. дистиллированной воды. Общий объем содержимого, как и в опытной пробирке – 10 мл. Через 10 мин. опытную и контрольную пробы проколориметрировать против дистиллированной воды на ФЭКе с зеленым светофильтром в сантиметровой кювете.

Расчет произвести:

Д _х* 10

Рмг. % = ----------- , где

Д_к

Д_х – оптическая плотность пробы,

Д _к– оптическая плотность контроля.

Данные занести в таблицу. Обсудить полученные результаты.

Таблица 19. показатели оптической плотности исследуемых растворов и содержания неорганического фосфора в крови

№ пробы	Показатели оптической плотности	Содержание фосфора в пробе, мг %	Физиологическая норма, мг %
опыт	контроль

Контрольные вопросы

- Содержание минеральных веществ в организме и их биологическая роль;

- Характеристика основных представителей макроэлементов;

Фосфор – элемент жизни, участие в важнейших реакциях обмена веществ;

- Представители микроэлементов и их роль в жизнедеятельности организма.

ЛИТЕРАТУРА

1. А.И. Кононский Биохимия животных. – 3-ие изд., перераб. и доп.- М.: Колос, 1992.-526с.

2. О.Д. Кушманова, Г.М.Ивченко. Руководство к практическим занятиям по биологической химии-М.:Медицина,1974.

3. А.Г. Малахов, С.И.Вишняков. Биохимия сельскохозяйственные животные. М.: Колос, 1984.-336с.

4. А.В.Чечеткин и др. Практикум по биологии животных. – М.: Высшая школа, 1980-330с.

5. В.В. Рогожин. Практикум по биологической химии. – СПб.: Издательство « Лань», 2006. – 256 с.