Лабораторные методы исследования
Исследование мокроты.Мокрота — патологическое отделяемое органов дыхания, выбрасываемое при кашле. В состав мокроты могут входить слизь, серозная жидкость, клетки крови и дыхательных путей, простейшие, редко гельминты и их яйца. Исследование мокроты помогает установить характер патологического процесса в органах дыхания, а в ряде случаев определить его этиологию.
Мокроту для исследования следует брать утреннюю, свежую, по возможности до еды и после полоскания рта. Только для обнаружения микобактерий туберкулеза мокроту можно собирать в течение 1—2 сут (если больной выделяетее мало). В несвежей мокроте размножается сапрофитная микрофлора, разрушаются форменные элементы. Для собирания мокроты используют специальные банки (плевательницы) с завинчивающимися крышками и мерными делениями.
Изучение мокроты начинают с ее осмотра сначала в прозрачной банке, а затем в чашке Петри, которую ставят попеременно на черный и белый фон. Отмечают следующие признаки.
Характер, цвет и консистенция мокроты. Слизистая мокрота обычно бесцветная, вязкая, встречается при остром бронхите. Серозная мокрота тоже бесцветная, жидкая, пенистая, наблюдается при отеке легкого. Слизи-сто-гнойная мокрота, желтая или зеленоватая, вязкая, бывает при хроническом бронхите, туберкулезе и т. д. Чисто гнойная мокрота однородная, полужидкая, зеленовато-желтая, характерна для абсцесса легкого при его прорыве. Кровянистая мокрота может быть как чисто кровяной при легочных кровотечениях (туберкулез, рак, бронхоэктазы), так и смешанного характера, например слизисто-гнойная с прожилками крови (при бронхоэктазах), серозно-кровянистая пенистая (при отеке легкого), слизисто-кровянистая (при инфаркте легкого или застое в системе малого круга кровообращения), гнойно-кровянистая, полужидкая, коричневато-серая (при гангрене и абсцессе легкого). Если кровь из дыхательных путей выделяется наружу не сразу, а длительно задерживается в них, ее гемоглобин превращается в гемосидерин и придает мокроте ржавый цвет (характерно для крупозной пневмонии).
При стоянии мокрота может расслаиваться. Для хронических нагноитель-ных процессов характерна трехслойная мокрота: верхний слой слизисто-гнойный, средний—серозный, нижний—гнойный. Иногда гнойная мокрота разделяется на два слоя — серозный и гнойный.
Запах. Чаще отсутствует. Зловонный запах свежевыделенной мокроты зависит от гнилостного распада ткани (гангрена, распадающаяся раковая опухоль) либо от разложения белков мокроты при задержке ее в полостях (абсцесс, бронхоэктазы).
Отдельные элементы, различимые невооруженным глазом. В мокроте могут быть обнаружены спирали Куршмана в виде небольших плотных извитых беловатых нитей; сгустки фибрина — беловатые и красноватые древовидно-разветвленные эластичные образования, встречаемые при фибринозном бронхите, изредка при пневмонии; «чечевицы» — небольшие зеленовато-желтые плотные комочки, состоящие из обызвествленных эластических волокон, кристаллов холестерина и мыл и содержащие микобактерии туберкулеза; пробки Дитриха, сходные с «чечевицами» по виду и составу, но не содержащие туберкулезных микобактерии и издающие при раздавливании зловонный запах (встречаются при гангрене, хроническом абсцессе, гнилостном бронхите); зерна извести, обнаруживаемые при распаде старых туберкулезных очагов; друзы актиномицетов в виде мелких желтоватых зернышек, напоминающих манную крупу; некротизированные кусочки ткани легкого и опухолей; остатки пищи.
Реакция среды. В мокроте реакция среды, как правило, щелочная; кислой она становится при разложении мокроты и от примеси желудочного сока, что помогает дифференцировать кровохарканье от кровавой рвоты.
Микроскопическое исследование мокроты. Производится как в нативных, так и в окрашенных препаратах. Для первых из налитого в чашку Петри материала отбирают гнойные, кровянистые, крошковатые комочки, извитые белые нити и переносят их на предметное стекло в таком количестве, чтобы при накрывании покровным стеклом образовался тонкий полупрозрач-
Рис. 27. Спирали Куршмана и кристаллы Шарко—Лейдена в мокроте.
ный препарат. Его просматривают сначала при малом увеличении для первоначальной ориентировки и поисков спиралей Куршмана, а затем при большом увеличении для дифференцирования форменных элементов. Спирали Куршмана представляют собой тяжи слизи, состоящие из центральной плотной осевой нити и спиралеобразно окутывающей ее мантии, в которую бывают вкраплены лейкоциты (часто эозинофильные) и кристаллы Шарко— Лейдена (рис. 27). Спирали Куршмана появляются в мокроте при спазме бронхов, чаще всего при бронхиальной астме, реже при пневмонии, раке легкого.
При большом увеличении в нативном препарате можно обнаружить лейкоциты, небольшое количество которых имеется в любой мокроте, а большое — при воспалительных и особенно нагноительных процессах; эозинофилы (рис. 28) можно отличить в нативном препарате по однородной крупной блестящей зернистости, но легче их узнать при окраске. Эритроциты появляются при разрушении ткани легкого, пневмонии, застое в малом круге кровообращения, инфаркте легкого и т. д.
Плоский эпителий попадает в мокроту преимущественно из полости рта и не имеет диагностического значения. Цилиндрический мерцательный эпителий в небольшом количестве присутствует в любой мокроте, в большом—при поражениях дыхательных путей (бронхит, бронхиальная астма). Альвеолярные макрофаги—крупные клетки (в 2—3 раза больше лейкоцитов) ретикулогистио-цитарного происхождения. Цитоплазма их содержит обильные включения. Они могут быть бесцветными (миелиновые зерна), черными от частиц угля (пылевые клетки) (рис. 29) или желто-коричневыми от гемосидерина (клетки сердечных пороков, сидерофаги). Альвеолярные макрофаги в небольшом количестве имеются в любой мокроте, содержание их увеличивается при воспалительных заболеваниях. Клетки сердечных пороков (рис. 30) встречаются при попадании эритроцитов в полость альвеол (при застое в малом круге кровообращения, особенно при митральном стенозе, инфаркте легкого, а также при крупозной пневмонии и гемосидерозе). Для более достоверного их определения ставят так называемую реакцию на берлинскую лазурь: немного мокроты помещают на предметное стекло, наливают 1—2 капли 5% раствора желтой кровяной соли, через 2—3 мин — столько же 2% раствора хлористоводородной кислоты, перемешивают и накрывают покровным стеклом. Через несколько минут зерна гемосидерина оказываются окрашенными в синий цвет.
Клетки злокачественных опухолей нередко попадают в мокроту, особенно если опухоль растет эндобронхиально или распадается. В нативном препарате эти клетки выделяются своим атипизмом: они большей частью крупные, имеют уродливую форму, крупное ядро, а иногда несколько ядер. При хронических воспалительных процессах в бронхах выстилающий их эпителий мета-плазируется, приобретает атипичные черты и может напоминать клетки опухоли. Поэтому определить клетки как опухолевые можно только в случае нахо-ждения комплексов атипичных и притом полиморфных клеток, особенно если они располагаются на волокнистой основе или вместе с эластическими волокнами.
Эластические волокна (рис. 31) появляются в мокроте при распаде легочной ткани: туберкулезе, раке, абсцессе. Эластические волокна имеют вид тонких двухконтурных волоконец одинаковой на всем протяжении толщины, дихотомически ветвящихся. Они нередко встречаются кольцевидными пучками, сохраняющими альвеолярное расположение. Так как эти волокна попадаются далеко не в каждой капле мокроты, для облегчения поисков прибегают к их концентрации. Для этой цели к нескольким миллилитрам мокроты прибавляют равное или двойное количество 10% раствора едкой щелочи и нагревают до растворения слизи. При этом растворяются все форменные элементы мокроты, кроме эластических волокон. После охлаждения жидкость центрифугируют, прибавив к ней 3—5 капель 1% спиртового раствора эозина, осадок микроскопируют. Эластические волокна сохраняют описанный выше характер и хорошо выделяются ярко-красным цветом.
Актиномицеты отыскивают, выбирая из мокроты мелкие плотные желтоватые крупинки — друзы. У раздавленной под покровным стеклом в капле глицерина или щелочи друзы под микроскопом видна центральная часть, состоящая из сплетения мицелия, и окружающая ее зона лучисто расположенных колбо-видных образований. При окрашивании раздавленной друзы по Граму мицелий приобретает фиолетовую, а колбочки — розовую окраску. Из других грибов, встречающихся в мокроте, наибольшее значение имеет Candida albicans, поражающий легкие при длительном лечении антибиотиками и у очень ослабленных людей. В нативном препарате находят почкующиеся дрожжеподобные клетки и ветвистый мицелий, на котором споры расположены мутовками.
Из кристаллов в мокроте обнаруживаются кристаллы Шарко—Лейдена: бесцветные октаэдры разной величины, напоминающие по форме стрелку компаса. Они состоят из белка, освобождающегося при распаде эозинофилов, поэтому встречаются в мокроте, содержащей много эозинофилов, причем больше их в несвежей мокроте. После легочных кровотечений, если кровь выделяется с мокротой не сразу, можно обнаружить кристаллы гематоидина — ромбические или игольчатые образования желто-бурого цвета.
Микроскопия окрашенных препаратов. Производится с целью изучения микробной флоры мокроты и некоторых ее клеток. Из них наиболее важно определение клеток злокачественных опухолей. Для этой цели мазок из найденного в нативном препарате подозрительного материала, сделанный с осторожностью, чтобы не раздавить клетки, фиксируют в метаноле или смеси Никифорова и окрашивают по Романовскому—Гимзе (или другой дифференциальной окраской). Для опухолевых клеток характерны полиморфизм величины и формы, наличие отдельных очень крупных клеток, большие часто гиперхромные и наряду с ними гипохромные ядра, иногда множественные, неправильной формы с крупными ядрышками; гомогенная, иногда вакуолизи-рованная цитоплазма в части клеток резко базофильная; нередко встречаются фигуры митоза. Наиболее убедительны комплексы полиморфных клеток указанного характера.
Для распознавания эозинофилъных лейкоцитов пригоден мазок, окрашенный по Романовскому—Гимзе или последовательно 1% раствором эозина (2—3 мин) и 0,2% раствором метиленового синего ('/j—1 мин). Единичные эозинофилы могут встретиться в любой мокроте: в большом количестве (до 50—90% всех лейкоцитов) они обнаруживаются при бронхиальной астме, эозинофильных инфильтратах, глистных инвазиях легких и т. п.
Бактериоскопическое исследование. Для данного исследованиямазки приготовляют, растирая комок мокроты между двумя предметными стеклами. Высохший мазок фиксируют, медленно проводя его 3 раза через пламя газовой горелки, и окрашивают: для поисков микобактерий туберкулеза—по Цилю—Нильсену, в других случаях — по Граму.
Окраска по Цилю—Нильсену. На фиксированный мазок накладывают равный по площади кусочек фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый фуксин Циля и нагревают на нежарком пламени до появления паров. Затем бумажку снимают, препарат промывают водой и опускают для обесцвечивания в 3% раствор хлористоводородной кислоты в 9° спирте (или в 5—10% раствор серной кислоты), снова хорошо промывают водой, докрашивают в течение '/2—1 мин 0,5% раствором метиленового синего и промывают водой. Кислотоупорные бактерии прочно удерживают принятую окраску, они не обесцвечиваются и остаются красными на синем фоне остальных элементов мокроты, обесцветившихся в кислоте и приобретающих дополнительную окраску.
В случаях, когда при бактериоскопии из-за малого количества микобактерий туберкулеза (рис. 32) обнаружить их не удается, прибегают к ряду дополнительных исследований. Так, при люминесцентной микроскопии обычным образом сделанный и фиксированный мазок окрашивают люминесцирующим красителем (родамин, акридин оранжевый), а затем другим красителем (кислый фуксин, метиленовый синий), гасящим свечение фона. В ультрафиолетовом свете люминесцентного микроскопа микобактерий светятся настолько ярко, что их можно заметить, пользуясь сухим объективом (40 х), охватывающим значительно большее поле зрения, чем иммерсионный. Методы накопления позволяют сконцентрировать микобактерий туберкулеза. Наиболее широко применяется метод флотации, при котором гомогенизированную щелочью мокроту взбалтывают с толуолом, ксилолом или бензином, мельчайшие капли которых, всплывая, захватывают микобактерий. Отстоявшийся сливкообра-зный слой углеводорода отсасывают пипеткой и наносят на подогретое стекло каплю за каплей на одно и то же место. После подсыхания препарат фиксируют и окрашивают по Цилю—Нильсену. Другим методом накопления является электрофорез: при прохождении постоянного тока через разжиженную мокроту микобактерий туберкулеза устремляются к катоду, с поверхности которого делают мазки и окрашивают по Цилю—Нильсену.
Окраска по Граму. На фиксированный на огне мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, на которую наливают карболовый раствор генцианового фиолетового. Через 1—2 мин бумажку сбрасывают, заливают мазок на 2 мин раствором Люголя, затем сливают его и опускают препарат в 96° спирт на '/г—1 мин (пока не перестанет отходить краситель), промывают водой и докрашивают в течение 1 мин разведенным в 10 раз раствором карболового фуксина.
В окрашенном по Граму препарате можно дифференцировать ряд микроорганизмов: грамположительные капсульный пневмококк, стрептококк и стафилококк, грамотрицательные клебсиеллу (капсульная диплобацилла Фридленде-ра), мелкую палочку Пфейффера и др. (рис. 33). Все эти микроорганизмы в небольшом количестве имеются в дыхательных путях здоровых людей и только при неблагоприятных для организма условиях могут стать патогенными и вызвать пневмонию, абсцесс легкого, бронхит и т. п. В этих случаях они обнаруживаются в мокроте в большом количестве.
Бактериологическое исследование (посев мокроты на питательные среды). Используют в том случае, когда бактериоскопиче-ское исследование не обнаруживает предполагаемого возбудителя. Бактериологическое исследование позволяет идентифицировать вид микробов, определять их вирулентность и лекарственную устойчивость, что необходимо для правильного подбора медикаментозных средств. Наконец, в некоторых случаях, когда более простыми способами возбудителя обнаружить не удается, мокротой, полученной от больного, заражают экспериментальных животных.
Исследование плевральной жидкости. Вполости плевры здорового человека имеется незначительное количество жидкости, близкой по составу к лимфе, облегчающей скольжение плевральных листков при дыхании. Объем плевральной жидкости может увеличиваться (выпот) как при нарушении крово- и лимфообращения в легких — невоспалительный выпот, или транссудат, так и при воспалительных изменениях плевры — экссудат. Экссудат может быть вызван клинически первичной инфекцией плевры или являться сопутствующим при некоторых общих инфекциях и при ряде заболеваний легких и средостения (ревматизм, инфаркт, рак и туберкулез легких, лимфогранулематоз и т. п.). Исследование плевральной жидкости проводят для следующих целей: 1) определения ее характера (транссудат, экссудат, гной, кровь, хилезная жидкость); 2) изучения клеточного состава жидкости, дающего сведения о характере патологического процесса, а иногда (при нахождении опухолевых клеток) — и о диагнозе; 3) выявления в случае инфекционного характера поражения возбудителя и определения его чувствительности к антибиотикам. Анализ плевральной жидкости складывается из макроскопического, физико-химического, микроскопического и в ряде случаев микробиологического и биологического исследований.
Макроскопическое исследование. Внешний вид плевральной жидкости зависит в основном от ее клеточного и частично от химического состава. Различают выпоты серозный, серозно-фибринозный, фибринозный, се-розно-гнойный, гнойный, гнилостный, геморрагический, хилезный и хилезо-подобный.
Транссудат и серозный экссудат прозрачны или слегка опалесцируют. Помутнение экссудата бывает обусловлено обилием лейкоцитов (серозно-гной-ный и гнойный экссудат), эритроцитов (геморрагический экссудат), капелек жира (хилезный экссудат), клеточного детрита (хилезоподобный экссудат). Характер клеток распознается при микроскопии. Хилезный характер экссудата определяют пробой с эфиром — при его добавлении мутность исчезает. Такой выпот бывает обусловлен застоем лимфы либо разрушением грудного лимфатического протока опухолью или травмой. Хилезоподобный вид экссудат принимает при жировом перерождении клеток, содержащихся в обильном количестве. В обоих случаях жир окрашивается Суданом III.
Цвет транссудата бледно-желтый, серозного экссудата — от бледно- до золотисто-желтого, при желтухе — до насыщенно-желтого. Гнойный экссудат серовато-белесоватый, зеленовато-желтый, при примеси крови — с красным оттенком или, чаще, коричневато-серый; такой же цвет у гнилостного экссудата. Геморрагический выпот в зависимости от количества крови и срока ее нахождения в плевре может иметь различные оттенки: от розового до темно-красного и бурого. При гемолизе выпот приобретает лаковый вид. Хилезный экссудат похож на разбавленное молоко.
Консистенция транссудата и экссудата, как правило, в большинстве случаев жидкая. Гнойный экссудат бывает густым, сливкообразным, иногда с трудом проходит через пункционную иглу. Гной из старых осумкованных эмпием может быть пюреобразным, крошковатым, с хлопьями фибрина.
Запахом (неприятным, зловонным) обладает только гнилостный экссудат, наблюдаемый при гангрене легкого. Этот запах обусловлен распадом белка, производимым ферментами анаэробной флоры.
При физико-химическом исследовании плевральной жидкости наибольшее значение имеет определение относительной плотности и содержания белка, так как они являются главными критериями при различении экссудатов и транссудатов.
Относительную плотность плевральной жидкости определяют ареоме-тром; обычно для этой цели используют урометр (см. «Анализ мочи»). Относительная плотность транссудата меньше 1,015, чаще в пределах 1,006—1,012, экссудата — выше 1,015, преимущественно 1,018—1,022.
Содержание белка в транссудате меньше, чем в экссудате, и составляет не более 3% (обычно 0,5—2,5%), в экссудате — 3—8%. Из способов его определения в плевральной жидкости наиболее удобен рефрактометрический, но могут быть применены и другие методы: биуретовый, гравиметрический, способ Ро-бертса—Стольникова (см. ((Анализ мочи») и др. Состав белковых фракций экссудата приближается к таковому в сыворотке крови; в транссудате значительно преобладают альбумины; фибриноген в нем почти или совсем отсутствует, поэтому транссудат не свертывается. В экссудатах фибриногена меньше, чем в крови (0,05—0,1%), но достаточно для спонтанного свертывания большинства из них. Содержание общего белка в транссудате изредка доходит до 4—5%; в таких случаях для дифференцирования транссудата от экссудата прибегают к дополнительным пробам.
Проба Ривальты: цилиндр заполняют водой, подкисленной несколькими каплями уксусной кислоты, и наливают в него 1—2 капли пунктата. Капли экссудата, опускаясь, оставляют за собой мутный след, подобный папиросному дыму; капли транссудата не оставляют следа.
Проба Лукерини: к2млЗ% раствора перекиси водорода на часовом стекле (на черном фоне) прибавляют каплю пунктата. В случае экссудата появляется опалесцирующее помутнение. Обе пробы выявляют присутствие в экссудате серозомуцина—мукополисахаридного комплекса, отсутствующего в транссудатах.
Микроскопическое исследование. Данному исследованию подвергают осадок плевральной жидкости, получаемый при ее центрифигурова-нии. Экссудат может свернуться до или во время центрифугирования, тогда осадок его непригоден для исследования, так как больпйшство клеток будет «захвачено» сгустком. Для предупреждения свертывания в пунктат прибавляют цитрат натрия или гепарин. Клетки осадка изучают несколькими методами: исследуют нативные препараты, сухие мазки, окрашенные по Романовскому—Гимзе или Папаниколау; при поисках клеток опухоли используют также флюоресцентную микроскопию, гистологическое исследование заключенного в парафин осадка или культуру клеток.
Для приготовления нативного препарата каплю осадка помещают на предметное стекло и накрывают покровным. Препарат рассматривают с сухой системой в простом или фазово-контрастном микроскопе. Оценивают количество форменных элементов (много, умеренное количество, немного). Точный подсчет лейкоцитов и эритроцитов не имеет особого значения, так как количество их в препарате зависит в большой мере от длительности и быстроты центрифугирования. Небольшое число эритроцитов может быть во всяком пункта-те за счет травмы при проколе; их много также в геморрагическом экссудате при опухолях, травме и геморрагическом диатезе. Большое количество лейкоцитов встречается при бактериальной инфекции плевры. В транссудате лейкоцитов немного, но часто много клеток мезотелия. Иногда в выпоте обнаруживают клетки, подозрительные на опухолевые, но точно установить их природу в нативном препарате затруднительно. Из осадка с минимальным количеством надосадочной жидкости делают мазки. Окраска дает возможность дифференцировать элементы осадка: нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, макрофаги, клетки мезотелия и опухолей. Лейкоциты выглядят так же, как в крови.
Клетки мезотелия крупные, округлые или полигональные, изредка с 2—3 ядрами. В круглом ядре с довольно нежной хроматиновой сетью иногда заметно ядрышко. Цитоплазма синяя, часто вакуолизированная. Макрофаги отличаются от моноцитов наличием в цитоплазме продуктов фагоцитоза. Клеткиопухоли имеют те же особенности, которые описаны в разделе «Исследование мокроты». Определение их в плевральной жидкости представляет большие трудности, так как клетки мезотелия в случае длительных, а иногда и острых поражений плевры, а также при транссудатах приобретают многие черты, свойственные бластомным клеткам. Здесь может помочь люминесцентная микроскопия: при окраске некоторыми флюорохромами (акридин оранжевый, родамин) опухолевые клетки светятся иначе, чем нормальные.
В первые 5—7 дней после появления выпота любой этиологии в нем обнаруживаются нейтрофильные лейкоциты, которые в дальнейшем при туберкулезном и ревматическом плеврите сменяются лимфоцитами. Богатый нейтро-филами выпот наблюдается при инфицировании плевры гноеродной флорой. Встречаются экссудаты, содержащие значительное, иногда преобладающее, количество эозинофилов.
Микробиологическое исследование. Транссудаты, как правило, стерильные, но могут быть инфицированы при многократных пункциях. Экссудаты могут быть стерильными, например выпоты при ревматической пневмонии, раке легкого. В серозном экссудате туберкулезной этиологии бактериоско-пически обнаружить микобактерии обычно не удается, но посев или прививка пунктата морским свинкам дает иногда положительный результат. При плевритах, вызванных гноеродной флорой, она часто может быть обнаружена уже при бактериоскопии окрашенного по Граму мазка; в противном случае необходимо произвести посев. Кроме пневмококков, стрептококков, стафилококков, энтерококков, в экссудатах встречаются клебсиеллы, палочки Пфейффера, кишечная палочка и др. Для целенаправленного лечения больного выявленные микроорганизмы проверяют на чувствительность их к антибиотикам.
Исследование промывных вод бронхов.Производят с целью обнаружения в них микобактерии туберкулеза (например, у больных, не выделяющих мокроты) или клеток злокачественных опухолей. После анестезии глотки и гортани раствором лидокаина больному, лежащему на боку, соответствующему пораженному легкому, медленно вводят гортанным шприцем в гортань и трахею 10—12 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия. Попавший в бронх раствор вызывает раздражение его слизистой оболочки, сопровождающееся отделением слизи и кашлем. Выделяющиеся с кашлем промывные воды собирают в стерильную посуду. Микобактерии в них ищут методом флотации или посевом. Для цитологического исследования промывные воды центрифугируют и из осадка приготовляют нативные препараты и мазки. Первые рассматривают в обычном фазово-контрастном или люминесцентном микроскопе (после флюорохромирования), вторые окрашивают по Романовскому—Гимзе либо флюорохромами для люминесцентной микроскопии.