С помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы)

Это наиболее популярный метод синтеза генов. Матричной РНК обычно много в клетках, специализирующихся на синтезе определенного белка. Она не содержит интронов соответствующих генов, поэтому может транслироваться в бактериальной клетке. Обратная траи-скриптаза — РНК-зависимая ДНК-полимераза — образует копии ДНК с геномов мРНК.

В генетической инженерии обычно используют фермент, кодиру-

емый вирусом миелобластоза птиц. Для получения полноразмериой копии гена с мРНК необходим праймер. Так как все мРНК на З'-кон-це несут полиадениловую последовательность, то в качестве праимера используют присоединяющийся к ней олигонуклеотид (политимиди-новую последовательность). Далее, используя его, ревертаза синтезирует на матрице мРНК однонитевую ДНК-копию. По непонятным причинам в конце мРНК обратная транскриптаза, копируя часть кДНК, образует однонитевую петлю с З'-ОН-концом. Далее щелочью гидро-лизуют мРНК и приступают к синтезу второй нити кДНК. Прайме-ром для этой цели служит З'-ОН-конец петли. Полимеризацию ведут последовательно ДНК-полимераза I и обратная транскриптаза. На заключительном этапе с помощью нуклеазы SI гидролизуют петли и получают полноразмерные двухнитевые копии генов.

Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Также в том, что легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК. Недостатком является то, что синтезируемые структурные гены получают без необходимых для их функционирования регуля-торных элементов. Синтез последних может быть достигнут получением ДНК-копий не мРНК, а про-мРНК либо путем подстановки полученного структурного гена под контроль регуляторных элементов клетки-хозяина.

Вторым этапом получения нужного гена является постановка его на контроль регуляторных элементов клетки-хозяина или того вектора, которым будут трансформировать клетку-реципиент. Известно, что структурная организация участков инициации транскрипции и трансляции отличается у про- и эукариот, а также у высших и низших (дрожжи) эукариот. Поэтому ферменты микроорганизмов не способны эффективно и правильно использовать регуля-торные элементы высших организмов. К осуществлению эффективной экспрессии чужеродных генов у микробов существует три подхода.

Наиболее простой вариант — внедрение чужеродного гена внутрь структурного гена. В этом случае бактериальная или дрожжевая клетка использует регуляторные элементы собственного гена. Единственным условием такого конструирования является то, что встройка чужеродного гена должна быть осуществлена в правильной рамке считывания.

Недостатком данного метода является производство клеткой химерного белка, из которого нужный продукт выделяют методом химического расщепления. Способ применим для получения ряда продуктов, особенно небольших пептидов, таких, как соматостатин. Последние пептиды часто являются нестабильными продуктами из-за активного протеолиза. Важно, что в составе химерных белков стабильность пептидов повышается.

Второй метод — метод прямой экспрессии. В этом случае стыковка структурного гена производится в области инициации трансляции с образованием гибридного сайта узнавания рибосомами. Такой способ позволяет получать почти естественный чужеродный белок, обычно с лишним медиониновым остатком на ЬШ₂-конце полипептидной цепи. Последнее обстоятельство связано с тем, что многие необходимые нам белки человека, такие, как инсулин или интерфероны, синтезируются в виде предшественников с сигнальной последовательностью на NH₂-KOHue, которая отщепляется в процессе их выхода из клетки. Правильный процесс отщепления сигнальных последовательностей в бактериальной клетке не всегда возможен, поэтому в конструкцию вводят перед структурным геном кодон инициации трансляции (Met ATG):

старт мРНК

промотор

структурная часть чужеродного гена

гибридный участок связывания рибосом

Третий метод — метод «гибридного оперона» с частично перекрывающимися генами. При этом чужеродный ген встраивается за начинающим геном оперона таким образом, что сайт инициации трансляции первого перекрывается на один нуклеотид сайтом терминации трансляции второго. В этом случае рибосомы, начавшие трансляцию первого белка, терминируют его синтез, но не покидают матрицу, а приступают к трансляции чужеродного белка. Ген первого белка оперона не является необходимым, а следовательно, в его структурную часть можно ввести дополнительный сайт связывания с рибосомами. Это обеспечит трансляцию чужеродного белка даже с большей эффективностью, чем первого белка оперона:

старт мРНК

SD₄

ATG.... SD_U

TGATG..... стоп

кодон

участки связывания рибосом