Конструирование штамма-суперпродуцента
рибофлавина (витамина В2)
на базе Bacillus subtilis
Другой пример успешного использования метода генной инженерии для создания промышленного штамма — это работа по конструированию продуцента витамина В2 (рибофлавина) на базе В. subtilis. В нашей стране существует микробиологическое производство рибофлавина, используемого в качестве добавки в корма сельскохозяйственных животных. Оно основано на культивировании гриба Erimotecium ashbyii. Однако время ферментации при этом составляет более 70 ч, а концентрация продукта не превышает 2,0 г/л.
Сложность данной работы заключалась прежде всего в том, что методы генной инженерии и генетики для В. subtilis не так хорошо развиты, как для Е. coli. Поэтому были разработаны теоретические основы клонирования и трансформации плазмид в бациллы. В частности, выяснено, что для успешной трансформации бацилл мономерной формой плазмидной ДНК необходимо, чтобы в состав плазмид входили обратные или прямые повторы. В результате был сконструирован удачный вектор с инвертированными повторами — плазмида рМХЗО, которая способна трансформировать клетки В. subtilis в мономерной форме, включать в свой состав крупные фрагменты ДНК и, что самое главное, она стабильно поддерживается в бактерии без специальных селективных приемов. Семь генов, ответственных за биосинтез рибофлавина, сгруппированы у В. subtilis в один оперон (размер оперона 6,3 к Да). Мутации, дерепрессирующие активность рибофлавинового оперона, были получены путем селекции штаммов, устойчивых к аналогам рибофлавина: 8-амино(нор)рибофлавину, 8-рибатиламино(нор)рибофлавину, розеофлавину. Клонирование му-
тагешюго рибофлавииового опероиа на плазмиде рМХЗО с последующей селекцией позволило создать штамм В. subtilis, способный за 25 — 35 ч роста при 37 °С в условиях аэрации выделять в культу-ральную среду 3,5 — 4,5 г/л витамина В2 при наличии в среде в качестве источника углерода мелассы (или сахарозы).
Создание нового' штамма-продуцента позволяет поднять продуктивность заводского производства минимум в четыре раза без больших капитальных затрат.
Метаболическая инженерия
Помимо работ по созданию штаммов-суперпродуцептов первич-ных и вторичных метаболитов одним из ведущих направлений генетической инженерии является изменение метаболизма некоторых перспективных продуцентов ценных продуктов.
Так, разработан способ получения богатого белком корма, заключающийся в выращивании бактерии Methylophilus methylotrophus на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода метанол. Процесс тем экономичнее, чем выше конверсия последнего в бактериальный белок. Исследователи обратили внимание на то, что М. methylotrophus обладают системой усвоения аммонийного азота (NHj)» включающей два фермента — глутаминсинтетазу и глута-матсинтазу, и не обладают способностью ассимиляции NHJ при участии глутаматдегидрогеназы, в то время как Е. coli имеет две системы.
Путь усвоения NHJ через исходный синтез глутамата экономит одну молекулу АТФ на каждую молекулу глутаминовой кислоты, что энергетически является более выгодным. Однако традиционная селекция, включающая мутагенез и отбор, не может придать М. methy-lotrophus свойство, которое определяется наличием нового гена. Авторы использовали методологию генной инженерии и перенесли ген глутаматдегидрогеназы Е. coli в клетки М. methylotrophus в составе многокопийной гибридной плазмиды и одновременно нарушили обычный путь усвоения азота введением соответствующих мутаций в ген глутаминсинтетазы.
В результате изменения пути усвоения азота клетки М. methylo-trophus стали способны к более высокой конверсии метанола в белок (возросла на 4 — 7 %). Данная работа является примером нового направления генно-инженерных подходов к трансформации микроорганизмов, а именно изменения путей основного метаболизма клетки.