Конструирование штамма-суперпродуцента

рибофлавина (витамина В2)

на базе Bacillus subtilis

Другой пример успешного использования метода генной ин­женерии для создания промышленного штамма — это работа по кон­струированию продуцента витамина В2 (рибофлавина) на базе В. subtilis. В нашей стране существует микробиологическое произ­водство рибофлавина, используемого в качестве добавки в корма сель­скохозяйственных животных. Оно основано на культивировании гри­ба Erimotecium ashbyii. Однако время ферментации при этом составляет более 70 ч, а концентрация продукта не превышает 2,0 г/л.

Сложность данной работы заключалась прежде всего в том, что методы генной инженерии и генетики для В. subtilis не так хорошо развиты, как для Е. coli. Поэтому были разработаны теоретические основы клонирования и трансформации плазмид в бациллы. В част­ности, выяснено, что для успешной трансформации бацилл мономер­ной формой плазмидной ДНК необходимо, чтобы в состав плазмид входили обратные или прямые повторы. В результате был сконстру­ирован удачный вектор с инвертированными повторами — плазмида рМХЗО, которая способна трансформировать клетки В. subtilis в мо­номерной форме, включать в свой состав крупные фрагменты ДНК и, что самое главное, она стабильно поддерживается в бактерии без специальных селективных приемов. Семь генов, ответственных за биосинтез рибофлавина, сгруппированы у В. subtilis в один оперон (размер оперона 6,3 к Да). Мутации, дерепрессирующие активность рибофлавинового оперона, были получены путем селекции штаммов, устойчивых к аналогам рибофлавина: 8-амино(нор)рибофлавину, 8-рибатиламино(нор)рибофлавину, розеофлавину. Клонирование му-


тагешюго рибофлавииового опероиа на плазмиде рМХЗО с последу­ющей селекцией позволило создать штамм В. subtilis, способный за 25 — 35 ч роста при 37 °С в условиях аэрации выделять в культу-ральную среду 3,5 — 4,5 г/л витамина В2 при наличии в среде в качестве источника углерода мелассы (или сахарозы).

Создание нового' штамма-продуцента позволяет поднять продук­тивность заводского производства минимум в четыре раза без боль­ших капитальных затрат.

Метаболическая инженерия

Помимо работ по созданию штаммов-суперпродуцептов первич-ных и вторичных метаболитов одним из ведущих направлений гене­тической инженерии является изменение метаболизма некоторых пер­спективных продуцентов ценных продуктов.

Так, разработан способ получения богатого белком корма, заклю­чающийся в выращивании бактерии Methylophilus methylotrophus на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода метанол. Процесс тем экономичнее, чем выше конверсия последнего в бактериальный белок. Исследователи обратили внимание на то, что М. methylotrophus обладают системой усвоения аммонийного азота (NHj)» включающей два фермента — глутаминсинтетазу и глута-матсинтазу, и не обладают способностью ассимиляции NHJ при уча­стии глутаматдегидрогеназы, в то время как Е. coli имеет две систе­мы.

Путь усвоения NHJ через исходный синтез глутамата экономит одну молекулу АТФ на каждую молекулу глутаминовой кислоты, что энергетически является более выгодным. Однако традиционная селекция, включающая мутагенез и отбор, не может придать М. methy-lotrophus свойство, которое определяется наличием нового гена. Авто­ры использовали методологию генной инженерии и перенесли ген глутаматдегидрогеназы Е. coli в клетки М. methylotrophus в составе многокопийной гибридной плазмиды и одновременно нарушили обыч­ный путь усвоения азота введением соответствующих мутаций в ген глутаминсинтетазы.

В результате изменения пути усвоения азота клетки М. methylo-trophus стали способны к более высокой конверсии метанола в белок (возросла на 4 — 7 %). Данная работа является примером нового направления генно-инженерных подходов к трансформации микро­организмов, а именно изменения путей основного метаболизма клет­ки.