Задачи и проблемы генетической инженерии растений

Основная цель генетической инженерии растений — выделение гена, определяющего полезный для культуры признак, и перенесение его в геном другой культуры, где этот новый ген должен стать частью наследственного аппарата.

Молекулярные биологи обратили внимание на растения как на объект исследования относительно недавно. Одна из причин - отсут­ствие среди них такого модельного объекта, каким стала Е. coli. Сей­час реальным кандидатом на эту роль становится двудольное расте­ние арабидопсис. Интерес, проявленный к нему молекулярными гене­тиками, объясняется очень коротким циклом его генерации, малым размером его генома и удобством для клонирования генов.

Работа с растениями имеет одно немаловажное преимущество — они могут быть регенерированы из клеточной массы (каллуса) или из


недифференцированных соматических тканей в зрелые, способные к размножению (фертильные) растения.

Однако на пути использования новой технологии гибридных ДНК возникает серьезное препятствие - это отсутствие основательных знаний о регуляции работы генов в процессе развития растения.

Понятие «генетическая инженерия растений» включает работы на клеточном уровне и учитывает все аспекты культуры клеток и тканей, молекулярную биологию и перенос генов. Основное препятствие для введения ДНК в растительные клетки - клеточная стенка. Поэтому используют растительные протопласты (отдельные растительные клет­ки, стенки которых удалены обработкой целлюлолитическими фер­ментами), аналогичные сферопластам дрожжей, которые в питатель­ной среде сохраняют жизнеспособность и при определенных услови­ях культуры образуют новые клеточные стенки с последующим деле­нием и регенерацией из них целых растений. Разработан метод слия­ния протопластов и получения на их основе соматических гибри­дов.

В настоящее время на первый план выдвигаются две проблемы. Первая — идентификация и выделение генов, предназначенных для переноса в растение с целью приобретения им нового полезного при­знака. Вторая — разработка простых и доступных методов этого переноса с последующей работой новых генов в растениях.

Методы переноса генов в растения можно разделить на две основ­ные группы: 1) с помощью векторных систем и 2) альтернативные методы прямого переноса.

Несмотря на все перечисленные сложности, генетическая инжене­рия растений вносит два существенных изменения в селекционную программу. Первое — это потенциальная экономия места и времени, поскольку получение образцов в лабораторных условиях исключает необходимость использования больших площадей для выращивания тысяч культур и может сократить время их созревания. Второе — это введение элемента точности в процесс селекции, поскольку иссле­дователь получает возможность манипулировать определенным мате­риалом в виде уже известных нуклеотидных последовательно­стей.

Агробактериальные трансформирующие

Векторы растений

Агробактерии и ризобии относятся к семейству Rhizobiaceae. Бактерии этих родов способны взаимодействовать с высшими расте­ниями, они вызывают различные новообразования. Так, после инфи­цирования культур агробактериями образуются опухоли, а штаммы ризобий — симбионты — вызывают образование корневых клубень­ков, способных осуществлять азотфиксацию у бобовых.

С проблемами генетической инженерии растений непосредствен-


но связан процесс опухолеобразовапия. В случае агробактерий обра­зуются настоящие опухоли с неограниченным опухолевым ростом клеток хозяина. Вирулентные их штаммы вызывают три вида рака у растений: корончатый галл (Л, tumefaciens), бородатый корень (A. rhisogenes), стеблевой галл (Л. rubi). Опухоли, вызванные агро-бактериями, представляют собой типичные неоплазмы, т. е. злокаче­ственные новообразования, которые могут автономно размножаться в отсутствие бактерий. Это пока единственный пример опухолей среди растений и животных, которые вызываются бактериями.

После заражения растения агробактериями опухоли, развиваю-щиеся из одной или нескольких клеток, быстро разрастаются в круп­ные образования. Иногда на периферии таких наростов формируют­ся листовидные структуры, подобия побегов или корешков. Круг хо­зяев агробактерий чрезвычайно широк: голосемянные, большинство двудольных, некоторые однодольные (лилейные). Естественную устойчивость имеют кукуруза, пшеница, рожь, овес, рис, сахарный трост­ник, все низшие растения. В целом опухоли не убивают растения, но существенно подавляют их общий рост, жизнеспособность, повышают восприимчивость к грибным инфекциям и стрессам. Однако ряд ра­стений погибают (например, виноградная лоза).

Корончатый галл как болезнь растений описан еще Аристотелем. В 1947 г. А. Браун культивировал ткани галла на искусственной среде с сахарозой и неорганическими солями, они росли быстро даже без добавления гормонов (цитокипов и ауксинов). Оказалось, что для индукции опухоли достаточно лишь кратковременного контакта бактерий с растениями, а само ее развитие может происходить в от­сутствие бактерий, т. е. после заражения размножение опухолевых клеток происходит независимо от их присутствия. Эти наблюдения позволили Брауну заключить, что растительные клетки каким-то обра­зом трансформируются после воздействия агробактерий. На основа­нии этого было выдвинуто предположение, что бактерии вводят в хозяйскую клетку некий фактор, приводящий к перерождению нор-мальиых клеток в клетки корончатого галла. Этот фактор ответстве-нен лишь за первичную индукцию опухоли, но не за ее последующее развитие. В результате его действия изменяются или полностью пре­кращаются нормальные процессы роста и дифференциации расти­тельной ткани.

В дальнейших исследованиях выявилось, что по своей химиче­ской природе опухолеобразующий фактор представляет собой нукле­иновую кислоту. Исследователи стали определять фракции ДНК, присутствующие в онкогенных штаммах и отсутствующие в иеонко-гениых. Бельгийские исследователи выявили, что оикогеиность агро­бактерий обусловлена присутствием в них группы ковалентпо замк-путых кольцевых плазмидных ДНК (1 - 2 копии в бактерии). Эти плазмиды получили обозначение Ti (tumor inducing).

В 1977 г. генетики из США доказали, что опухоли возникают в


результате включения определенного фрагмента Ti-плазмид агробак-терий в растительную ДНК. Он получил обозначение Т-ДНК (trans­fer — перенесенный), т. е. инфекционный процесс, вызванный агро-бактериями, развивается на генетическом уровне.

На основе экспериментальных данных можно представить сле­дующую картину образования корончатых галлов (рис. 4).


       
   
 



Agrobacterium tumefaciens


Трансформированная растительная клетка


Корончатый

галл


Рис. 4. Схема образования корончатых галлов

Агробактерии, содержащие специфические ТЛ-плазмиды, проникая через поврежденную, раневую ткань, заражают растения. Часть плазмидиой ДНК попадает в растительную клетку. Т-ДНК вырезается из Ti-плаз-миды и встраивается в хромосому растительной клетки. В результате фрагмент бактериальной ДНК становится частью наследственного ап­парата растения и начинает экспрессироваться наряду с генами куль­туры. Его работа запускает процесс опухолеобразования.

Во-первых, начинается неконтролируемое деление клеток, в ре­зультате чего образуется опухоль. Во-вторых, в опухолевых клетках синтезируются необычные соединения, не встречающиеся больше нигде в природе, названные опинами; по ним можно тестировать опухоле­вую клетку.

Опины (производные обычных участников метаболизма — амино­кислот и различных кетокислот или Сахаров) — биологически актив­ные соединения нового класса, обнаруживаемые только в тканях ко­рончатых галлов у растений. Эти низкомолекулярные метаболиты служат ростовыми веществами для агробактерии.

В-третьих, появляется еще одно новое свойство — гормононеза-висимый рост опухолевых растительных клеток.

Биологический смысл этого явления заключается в том, что Ti-плазмида действует как природный инструмент для переноса но­вых генов в растения, следовательно, может служить эксперименталь­ным вектором для введения любых ДНК в геном растений. Молеку­лярных биологов интересует механизм переноса и встраивания Т-ДНК в растительную хромосому. Знание этих процессов оказалось очень важным для осуществления экспериментального введения чу­жеродных генов в растения.


Векторы на основе Ti-плазмид агробактерий.Обнаружение ес­тественной системы переноса генов в растения с помощью Ti-плазмид стимулировало исследования в направлении использования их как векторов для генетической инженерии растений. Т-ДНК обладает свойствами, которые весьма желательны для универсального вектора генетической инженерии растений, а именно: широким спектром хо­зяев, эффективным способом инфекции, транскрипционной активно­стью и генетической стабильностью. Достаточно высока ее емкость: большие фрагменты чужеродной ДНК (длиной 50 тыс. пар нуклео-тидов и более), экспериментально встроенные в Т-ДНК, эффективно переносятся и внедряются в растительную хромосомную ДНК. Прежде чем природная Ti-плазмида будет использована как векторная систе­ма, ее необходимо модифицировать (рис. 5).



Х-ген

ДНК

Е. coli


A. tumefaciens


Т-ДНК


Х-ген


 



Т-ДНК


Х-ген


Ядерная ДНК


Х-ген

Трансгенное растение


Рис. 5. Схема клонирования чужеродного гена в растении с использованием Ti-плазмид агробактерий

Для этого первоначально ген X, который нам необходимо ввести в растения, клонируют в клетках Е. coli с использованием соответству­ющих векторных систем. Далее его в составе подходящего вектора вводят в клетки A. tumefaciens, где происходит встраивание гена X в Ti-плазмиду, а именно в Т-сегмент. Затем такой рекомбинаитной бак­терией обрабатывают клетки растений, где Т-ДНК, несущая ген X, встраивается в ядерную ДНК растительной клетки. В результате кло-


нирования таких рекомбинаитных растительных клеток с последую­щим регенерированием из них растений получаются трансгенные ра­стения, в геноме которых работает чужеродный геи X (см. рис. 5).

ч