Другие векторные системы, используемые в генетической инженерии растений
Наряду с Ti-плазмидами интенсивно разрабатываются векторы на основе ДНК органелл растительной клетки — хлоропластов и митохондрий. Это перспективный подход, ибо в отличие от других типов виехромосомных генетических элементов мтДНК может быть получена из любого эукариотического организма. Кроме того, в митохондриях растений помимо основной молекулы мтДНК найдены небольшие плазмидоподобные мтДНК. Эта кислота так же, как и хлоропла-стная ДНК, имеет множество гомологичных областей с ядерной ДНК, что делает возможным обмен или внедрение ДНК органелл в ядер-ную ДНКрастения.
Транспозируемые элементы, или транспозоиы, — это сегменты ДНК, которые сами контролируют свою собственную транспозицию (перемещение) из исходного сайта и интеграцию (внедрение) в новый сайт хромосомы (или плазмиды). Их применяют для введения новых генов в растения, подобно тому, как ретровирусы используют в качестве векторных систем для встраивания генов в животные клетки. Основное преимущество этих векторов — возможность их использования в экспериментах с однодольными растениями.
Рассмотрим, какие возможности для генетической инженерии растений таят в себе вирусы и вироиды, поражающие культуры. Типичным представителем переноса генов в растения является фитови-рус — вирус мозаики цветной капусты. Он вызывает мозаичное заболевание листьев преимущественно у крестоцветных. Симптомы инфекции проявляются через 2 — 3 недели. Использовать этот патоген в качестве вектора можно следующим образом. Основная задача — это включение необходимого гена X в состав вирусной ДНК и затем использование способности патогена размножаться и копировать свою ДНК в клетке, с тем чтобы вместе с увеличением числа копий вирусной ДНК происходил рост и числа копий гена X. Кроме того, внедрение последнего должно быть безболезненным для самого вируса, поскольку после внедрения он должен сохранить способность развивать инфекционный процесс в растении.
Стебли турнепса были инфицированы таким химерным вирусом, у которого вирусная ДНК содержала бактериальный ген устойчивости к яду — метотрексату. При размножении в клетках зараженного растения этого вируса размножался и бактериальный ген, в результате экспрессии которого в культуре образовался фермент, обусловливающий устойчивость к метотрексату.
Преимущества вирусных векторов:
1) легче вводить в растения, чем Ti-плазмиды;
2) вирус не только размножается в инфицированной клетке, но и переносится в различные органы растения, где накапливается огромное число копий вирусного генома и соответственно столько же копий чужеродного гена X; в результате обеспечивается сверхсиитез продукта, кодируемого этим геном.
Среди их недостатков можно отметить:
1) небольшую емкость вирусного вектора (в Т-ДНК — большие фрагменты чужеродной ДНК, а в вирусной ДНК — менее 800 пар пуклеотидов или один небольшой теп);
2) ограниченность круга поражаемых растений.
В 1971 г. выяснилось, что веретеиообразиость клубней вызывают небольшие пеиикапсулироваиные молекулы автономно удваивающейся РНК. Так были открыты вироиды — очень короткие цепи одиоиите-вой ковалеитио связанной кольцевой РНК, состоящие всего лишь из 270 — 300 пуклеотидов. В отличие от вирусов они не заключены в белковую оболочку. Все известные вироиды инфицируют своих хозяев персистентпо, т. е. не происходит выздоровления растения, и могут быть выделены из инфицированных культур в продолжение всего их жизненного цикла. Они заражают картофель, томаты, огурцы, виноград, кокосовую пальму и др. Вироиды вызывают системную инфекцию растений, т. е. могут мигрировать из сайта внедрения в другие его части, переносятся механически или через клеточный сок. Они связаны с ядерными фракциями растения и могут размножаться в ядрах. Поскольку вироиды содержат не ДНК, а РНК, методика работы с ними заключается в следующем. Сначала получают одионитевую ДНК-копию с вироидной РНК. Затем достраивают вторую, комплементарную, нить, получая кДНК, с которой и проводят манипуляции.