ПРИНЦИПЫ МАСШТАБИРОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ

Важное место в биотехнологических производствах занимает мас­штабирование ферментации, т. е. культивирование микроорганизмов в промышленных условиях (ранее говорилось о лабораторных ис­следованиях). Известно, что процесс, идущий в лабораторных услови­ях, в масштабах крупного производства может протекать неэффек­тивно (если вообще существует такая возможность). В лаборатории для биотехиолога важен высокий выход продукта на массу биомассы в единицах на 1 мл культуральной жидкости или за единицу времени, при переходе же к промышленным условиям приоритетной становит­ся задача максимального выхода продукта при минимальных энерге­тических (и других) затратах и времени. Значительная часть иссле-довапхйв биотехнологии посвящена масштабированию при аэроб-ных ферментациях, поскольку именно с этими процессами связаны сложные проблемы, касающиеся перемешивания и массопереноса.

Культивирование микроорганизмов в промышленных услови­ях — сложный процесс, зависящий от:

1) числа генераций микроорганизма;

2) способов культивирования;

3) стерилизации среды и воздуха;

4) перемешивания и аэрации;

5) переноса тепла;

6) стабилизации культуры. Рассмотрим подробнее все эти фак­торы.

Число генераций.Число генераций — это время, необходимое для достижения нужной конечной концентрации биомассы в объеме ферментера. Если предположить, что культура находится постоянно в экспоненциальной фазе роста, то

X=XQe/dt

или

¥з- = е^ (18)

где V — объем ферментера; х — концентрация биомассы; X — об­щая биомасса (V~); у. — специфическая скорость роста; е — основа-ние натурального логарифма; t - время. Учитывая известные взаимо-


отношения между ц, временем удвоения (td) и числом генераций (iVr), предыдущее уравнение можно записать как

¥х-=еыт1п2 (19)

или

Nr =l,44(lnV41n*-lnX0). (20)

Представленное уравнение показывает прямое отношение между числом генераций и логарифмом объема ферментера (верно для при­нятых условий о равном размере инокулюма Х0), говорит об идентич­ности ростовой среды, которая в свою очередь поддерживает одну и ту же конечную концентрацию биомассы — X. Если популяция кле­ток неоднородна, но вариант имеет ту же скорость роста, что и роди­тельский штамм, фракция вариантов через NT генераций будет

X Хт+Х„„(1-е-°'693л^)

---------- --------------------------- , ^21)

Л.т + Л.п ^-т ' •^•п

где Хт — биомасса варианта; Хп — биомасса родительского штамма; Хп и Хт — биомасса в момент инокулирования. В более общем слу­чае3, когд& родительский штамм и вариант имеют различные скорости роста, уравнение примет вид


Хп _ а + Х-1

Хт+Хп (й-1)-Я2^(й+х-°


(22)


где а — отношение специфической скорости роста варианта к скоро­сти роста родительского штамма; X — скорость появления вариантов, выраженная как число вариантов, образованных на геном / генера­цию. На практике может возникать несколько вариантов. Из урав­нений (21), (22) следует, что с увеличением масштабов ферментации частота возникновения нежелательных вариантов возрастает.

Стерилизация.В биотехнологических производствах стерилизу­ют среды, входящий и выходящий воздух, а также оборудование био­реактора для предотвращения заражения культуры во время фер­ментации. Для сред чаще всего используют тепловую стерилизацию, полнота которой зависит от вида микроорганизма, состава среды, зна­чения рН и размера суспендированных частиц. В лаборатории она легко достигается при автоклавировании в течение короткого перио­да времени. В производственных масштабах большие объемы сред (от 10 до 50 тыс. л) требуют большего времени для этой процедуры, что приводит к ухудшению их свойств. В настоящее время применя­ют непрерывную тепловую стерилизацию, где среда нагревается до 150 °С за несколько минут. С увеличением размеров емкости фер­ментера площадь его поверхности резко уменьшается относительно


объема, что затрудняет передачу тепла. В воздухе содержится 5 -2 000 микроорганизмов на 1 м3, из них 50 % — споры грибов, 40 % — грамотрицательные бактерии. Ферментеры обычно работают со ско­ростью аэрации, т. е. 0,5 — 1,0 объемов воздуха / (объем жидко­сти • мин). В современных условиях при стерилизации используют систему мембранных фильтров или фильтров из стекловолокна (рань­ше они были из стеклянных волокон, которые плохо выдерживали тепловую стерилизацию). Мембранные фильтры изготавливают из эфиров целлюлозы, полисульфоиа, нейлона. Их можно легко заме­нить в случае необходимости. Фильтров, предотвращающих зараже­ние бактериофагом, пока нет.

Перемешивание и аэрация.Для максимального выхода продуктов важными факторами являются: оптимальная температура культиви­рования, концентрация растворенного 02, одинаковый уровень рН в разных частях реактора, которые зависят от хорошего перемешива­ния. Аэрация выполняет две функции: обеспечение кислородом и удаление С02 и других летучих метаболитов из культуралыюи жид­кости. Сохранение постоянства KLa служит одним из главных прин­ципов масштабирования.

Перенос тепла.Культивирование микроорганизмов осуществля­ется при определенной температуре, и это требует поддержания теп­лового баланса в ферментере, который в общем виде выглядит так:

«метаб ^перемет— *^испар ^теплообмен ~ ^* \£3)

Чтобы удовлетворить этим условиям, необходимо удалить тепло из системы со скоростью теплообмена (Отеплообмен^' Его отвод обыч­но осуществляют с.помощыо специальных охладителей, содержащих воду. Поверхность обмена, доступная для удаления тепла из едини­цы объема жидкости, снижается при увеличении размеров масштаби­рования, что и определяет размеры биореактора. Это достигается тог­да, когда скорость образования тепла равна максимальной скорости его удаления:

Отеплообмен = UAC^T\m> (24)

где U — коэффициент общего переноса тепла, ккал / (м2 • ч); Aq — площадь теплообмена / объем жидкости, м2; ДГ1т - логарифм зна­чения разницы температур между культуралыюи и охлаждающей жидкостями. Масштабы ферментации отражаются в уравнении раз­личными способами, но главное влияние осуществляется через Aq, так как Aq « 1/Di} где D^ — диаметр мешалки. АГ]т обычно не за­висит от масштабирования, если используют один и тот же охлади­тель, но на Отеплообмен влияет скорость аэрации. Снижается величи­на U, так как приходится увеличивать толщину стенок для больших ферментеров. В целом при масштабировании перенос тепла умень­шается, что может влиять на размеры ферментера.


Стабильность культуры.При культивировании микроорганиз­мов возникает ряд проблем. Так, например, известны механизмы гене­тической нестабильности: возникают диссоциация гетерокариоиов, митотическое несоответствие у грибов, но общих методов контроля этих явлений нет. Возможный подход может состоять в том, чтобы отыскать вещества, селективно иигибирующие непродуктивные штам­мы, но это в настоящее время проблематично. В случае генно-инже­нерных штаммов, несущих плазмиды, существует сходная ситуация. Нестабильность может вызывать большую склонность плазмид к мутациям или их исчезновение.

Большие трудности возникают при масштабировании процессов с нитчатыми организмами, которые часто создают высокую вязкость и «неныотоиовскую» ферментацию. Это приводит к образованию иегомогенности культуры, высокорежущих зон и низкой вязкости вокруг лопастей мешалок, слаборежущих зон и высокой вязкости в отдалении от них, и все это отражается на массопереносе. Другая проблема, связанная с вязкостью, — это удаление тепла (пропорцио­нально градиенту температуры между культурой и теплообменником).

К параметрам, которые используют в качестве критериев при мас­штабировании, относят: постоянство потребления энергии на едини­цу питательной среды; сохранение (по сравнению с лабораторными условиями) той же объемной скорости переноса кислорода. Допол­нительным критерием может служить скорость мешалки, которая находится в области 5 — 7 м/с для многих продукционных фермен­теров. От их объема зависит время перемешивания. В сохранении одного и того же геометрического типа ферментера на пилотной установке и на заводе необходимости нет, если выполняются другие вышеуказанные условия. При масштабировании должно поддержи-ваться постоянство потребления энергии (на ед. объема). Для обес­печения указанного требования необходимо учитывать зависимость между потреблением энергии (Pg) и параметрами ферментера. Пред­ложенная В. Крюгером, она выглядит следующим образом:

Pg = K(P^NDf/Q°'56)0A5} (25)

где Pg — требуемая энергия для аэробного биореактора; К — кон­станта (функция геометрии ферментера); Р± — энергия, потребляемая иеаэрируемым ферментером; N — частота вращения мешалки, об/мин; Di — диаметр мешалки, см; Q — скорость аэрации, м3/(м3 • мин), т. е. объем воздуха на объем жидкости в минуту. Было установлено, что указанная выше зависимость верна для разных ферментеров от 20 л до 30 тыс. л.

В настоящее время происходит внедрение генно-инженерных штам­мов, а их практическая ценность выявляется после культивирования в промышленных условиях.


Очень часто плазмидные штаммы растут медленно, при этом сниже­ние скорости роста пропорционально величине плазмид. Кроме того, данное обстоятельство часто возникает по причине выработки клони­рованными генами продуктов высокого качества. Поэтому в промыш­ленности, где клетки проходят большое число генераций, возможно полное вытеснение плазмидных клеток дикими штаммами (сегрега­ционная нестабильность) или части плазмид (структурная нестабиль­ность).


Глава 5