По сульфгидрильным группам (-S-S-)

Сульфгидрильные группы в белках встречаются довольно редко, так как они быстро окисляются с образованием тиоловых дисульфид-ных мостиков. Вот это свойство и используется для ковалентной им­мобилизации. Если имеется фермент с SH-группой и носитель с ней же, то в присутствии кислорода они образуют прочную дисульфид-ную связь.


СН


SH + HS—№


О


Н


-S-S


Ф


Для увеличения возможности протекания такой иммобилизации существует два пути:

1) повышение числа сульфгидрильных групп в белке; это можно


сделать посредством обработки белка некоторыми восстановителя­ми — меркаптоэтаиолом, цистеипом, боргидратом натрия;

2) использование носителей с большим количеством тиолов. Для этого применяют аминопроизводные сефарозы и сефадекса, модифи­цированные гомоцистеинтиолактоном, сополимеры акриламида с тио-лосодержащими мономерами и т. д.

Б. Радикальные реакции

При фотохимическом распаде алкил- и арилазидов образуются очень реакциошюспособиые короткоживущие радикалы — питрены:

R N ►R—N + N2

Часто эти алкил- и арилазиды входят в состав носителей и сшива­ющих агентов (например, аминоэтилсульфаната). А нитрены реагиру­ют с очень многими группами белка. Если смесь носителя или сшива­ющего агента с алкил- и арилазидом и белок облучают УФ-лучами, то образуется очень прочная связь между иитренами и ферментом.

О

R—N3+H2—С—О—Ф

О О


R—N+H


О—Ф


О О


R—NH


О—Ф


О

Однако здесь нужна осторожность, поскольку часто длина волны максимума поглощения в области УФ алкил- и арилазидов может совпадать с длиной волны (250 — 300 нм), при которой разрушаются белки.

Применение иммобилизованных ферментов

В промышленности

Гидролитические ферменты.Гидролазы относятся к третьему клас­су ферментов, общим их свойством является то, что они катализируют реакции гидролиза, т. е. расщепления более сложных соединений на


более простые с присоединением воды. Этот класс подразделяется на 11 подклассов. Многие гидролазы компартментализированы в тех или иных структурных элементах клетки, отделенных от цитоплазмы мем­бранами. Видимо, такая их локализация защищает важные биополи­меры клетки от деструкции. Грамположительные бактерии выделяют в среду много гидролаз. У грамотрицательиых хранилищем послед­них служит периплазматическое пространство наружной оболочки, ограниченное двумя мембранами. В клетках эуокариот гидролазы могут локализоваться в особых органоидах — лизосомах, периплазме или выделяться в среду. Большинство используемых в промышленности гидролитических ферментов представляют собой внеклеточные про­дукты жизнедеятельности микроорганизмов. В то же время некото­рые из них обнаружены в цитоплазме, где они участвуют в метаболи­ческих циклах.

Амилазы — ферменты, катализирующие гидролиз крахмала, от­носятся ко второму подклассу гидролаз, имеют шифр 3.2.1. Они ши­роко распространены в природе, синтезируются многими микроорга­низмами, животными и растениями. К ним относятся а- и р-амилазы, глюкоамилаза и др. За последние 20 лет гидролиз крахмала для по­лучения сиропов различного состава приобрел наибольшее значение из всех промышленных процессов, использующих ферменты. Гидро-лизаты классифицируют согласно содержанию в них редуцирующих Сахаров в пересчете на глюкозу и характеризуют декстрозным экви­валентом (ДЭ), причем чистая глюкоза составляет 100 ДЭ. Подобрав комбинацию ферментов и условий, можно получить продукты с точно определенными физическими и химическими свойствами. Ниже при­ведена общая схема процесса (рис. 21).

После измельчения исходного материала крахмал диспергируют или желатинизируют в водном растворе и ожижают с помощью тер­мостабильной бактериальной а-амилазы при температуре от 80 до 110°С. Этот этап может быть заменен кислотным гидролизом, но, как правило, последний менее эффективен. Ожижение занимает от 2 до 4 ч и обычно завершается, когда величина ДЭ составляет 10 — 20. Оно сопровождается осахариванием, процедуру которого можно ва­рьировать в зависимости от желаемого продукта. Добавление пуллу-ланазы, фермента устраняющего ветвление, и Р-амилазы к декстринам приводит к получению сиропа с высоким содержанием мальтозы. По­скольку пригодные для этого микробные Р-амилазы остаются дефи­цитными, жидкость обычно готовят с помощью смеси грибной а-ами­лазы и глюкоамилазы. Такой продукт содержит больше глюкозы, но ее соотношение с мальтозой можно контролировать тщательным под­бором пропорций этих двух ферментов и условий реакции.

Важный промышленный процесс — производство глюкозы для изомеризации ее во фруктозу. После ожижения декстрины быстро охлаждают примерно до 60 °С и обрабатывают глюкоамилазой в течение 24 — 90 ч в зависимости от использованного количества


фермента. Осахаренный крахмал должен содержать не менее 94 — 96 % глюкозы, так как остаточные ди- и олигосахариды часто облада­ют неприятным вкусом, а изомераза не действует ни на один из них. После коррекции рН и ионной силы продукт обрабатывают изомера-зой.

Крахмал

Бактериальная а-амилаза Пуллуланаза


разветвленные и линейные олигосахариды

т

Глюкоамилаза

L

глюкоза


линейные олигосахариды

I

Р-Амилаза

мальтоза


Грибная а-амилаза

Глюкозоизомераза

мальтоза и мальтотриоза

сироп с высоким содержанием фруктозы

Рис. 21. Схема гидролиза крахмала

Проблема реализации непрерывной технологии стоит в эффек­тивной иммобилизации второго фермента — глюкоамилазы. Во-пер­вых, потому что а-амилаза считается более доступной и дешевой, и в принципе нет необходимости в ее регенерации. Ею обрабатывают крах­мал при кипячении в течение нескольких минут. Во-вторых, реакция иммобилизованной а-амилазы с малорастворимым, вязким крахмалом проходит с трудом. Кроме того, глюкоамилаза реагирует с раствори­мыми олигосахаридами, что сравнительно легко осуществить и для иммобилизованного фермента.

Сконструированы типы препаратов иммобилизованного фермента, обладающие хорошими свойствами, полученные ковалентным связы­ванием с пористым силикагелем через глутаровый диальдегид, вклю­чением в полые волокна триацетата целлюлозы, адсорбцией на ДЭАЭ-целлюлозе и т. д. Все эти препараты характеризуются высокой ста­бильностью при умеренных температурах (< 50 °С), время полуинак-


тивации составляет многие месяцы. Однако оно сокращается до 5 — б дней, если температура повышается, стабильность препаратов в этом случае резко падает. Схема пилотной установки для получения глю-козного сиропа с применением иммобилизованной глюкоамилазы при­ведена на рис. 22.



горячая вода


а-амилаза


                   
 
     
 
     
 


I

фильтр

±


сигнальное устройство

:„ ^

глюкозныи сироп

Рис. 22. Технологическая схема производства глюкозного сиропа

с применением иммобилизованной глюкоамилазы:

1 — резервуар для обработки крахмала паром; 2 — резервуар для обработки

а-амилазой; 3 — биореактор с иммобилизованной глюкоамилазои

Исходный крахмал помещается в резервуар объемом 1 м3 (1) , где обрабатывается паром в течение 3 — 4 мин под давлением и далее перекачивается в следующий резервуар такой же вместимости (2). Там он подвергается обработке а-амилазой.

После фильтрования разжиженный крахмал подается в реакци­онную колонну — биоректор (3), загруженный 16 кг иммобилизован­ного на микропористом кремнеземе фермента. Гидролиз декстринов проводится при температуре 40 °С. Время контакта 30%-го раствора декстринов с иммобилизованным ферментом составляет 9 мин, в то время как при гидролизе растворимой глюкоамилазои оно составляет при тех же условиях 72 ч.


Р-Галактозидаза (p-D-галактозидгалактогидролаза, лактаза, КФ 3.2.1.23) относится к глюкозидазам. Ферменты из разных источников по своей структуре, размеру молекулы, молекулярной массе и активно­сти различаются, что позволяет получать их виды с широким диапазо­ном действия. В результате гидролиза ферментом молочный сахар (лактоза) превращается в более сладкую и хорошо растворимую смесь моносахаров — глюкозы и галактозы, и поэтому препараты Р-галакто-зидазы широко применяют в молочной промышленности и в тех от­раслях, где можно использовать отходы молокоперерабатывающей промышленности, содержащие лактозу.

С12Н22°11 + Н2° -» С6Н12°6+ С6Н12°6

В Италии освоено промышленное производство безлактозного молока с применением иммобилизованной лактазы (рис. 23).

Рис. 23. Технологическая схема получения безлактозного молока

с использованием иммобилизованной лактазы:

1 — резервуар с молоком; 2 — биореактор с иммобилизованным ферментом;

3 — асептический резервуар

Снятое молоко из резервуара (1) пропускают через стерилизатор (температура — 142 °С, время — 3 сек), быстро охлаждают до 4 — 7 °С и прокачивают через реакционную колонну (2) в асептический резервуар емкостью 500 л (3). Биореактор емкостью 20 л содержал 4 кг иммобилизованного фермента, включенного в волокна триацетата целлюлозы. Волокна закрепляли вертикально в нижней и верхней точках реактора. Молоко через него можно пропускать многократно со скоростью 7 л/мин до достижения заданной степени конверсии. Производительность установки —Ют безлактозного молока в день. 228


В Англии запущен полупромышленный процесс гидролиза лакто­зы в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной (3-галактози-дазы. Установка находится в действии 5 дней в неделю непрерывно и обрабатывает 30 т сыворотки, производя 1,7 т сахарного сиропа (рис. 24).

Рис. 24. Технологическая схема установки для гидролиза лактозы

в молочной сыворотке (компания «Милк Маркетинг», Англия):

1 — резервуар для подготовки сыворотки; 2 — контроль рН; 3 — контроль

температуры; 4 - ионообменники; 5 - реакционная колонка с иммобилизованным

ферментом; 6 — резервуар с разбавленной уксусной кислотой

Сыворотку перед введением в биореактор подкисляют в резерву­аре (1), пастеризуют, производят ультрафильтрацию и пропускают через ионообменники (4) для деминерализации. После этого ее проводят через реактор (5) с иммобилизованной лактазой нисходящим пото­ком. Используемый здесь фермент ковалентно связан с пористым си­ликате лем с помощью глутарового диальдегида. Биореактор перио­дически очищают разбавленной уксусной кислотой из резервуара (б).

Мощность установки составляет 360 л/ч, а степень гидролиза — 80%.

Протеолитические ферменты — пептидгидролазы (шифр КФ 3.4), катализирующие гидролиз пептидов и белков. Основной реакцией, осуществляющейся при участии ферментов, является гид­ролиз пептидной связи. Биокатализаторы часто синтезируются в не­активной форме, т. е. в зимогенах, которые или хранятся в клетке, или


проходят от места их синтеза к тому центру, где они необходимы в активной форме. В частности, в клетке в неактивной форме транспор­тируются трипсин, пепсин, химотрипсин, карбоксидазы. Их активация осуществляется по одному из двух путей: а) образование активных ферментов из предшественников автокаталитически; б) образование активных форм в присутствии ионов металлов. Протеазы нашли ши­рокое применение в промышленности и в медицине (табл. 4).

Таблица 4

Применение протеаз

 

№ Фермент Источник Область применения
Трипсин Поджелудочная железа животных Медицина, мягчение мяса, осветле­ние пива
Пепсин Желудок животных Медицина, мягчение мяса, свертыва­ние молока
а-Химотрипсин Желудок животных Медицина
Ренин (химозин) Желудок теленка Производство сыра, свертывание молока
Панкреатическая протеаза Поджелудочная железа животных Медицина, производство моющих средств, мягчение и обезволашивание кожи
Папаин Папайя Медицина, осветление пива, мягчение мяса
Бромелаин Ананас Медицина, мягчение мяса, осветление пива
Фицин Инжир Медицина, мягчение мяса, осветление пива
Протеаза Aspergillus oryzae Осветление и вкусовая обработка сакэ
Протеаза Aspergillus niger Производство кормов, медицина
И Протеаза «Субтилизин» Bacillus subtilis Производство детергентов, мягчение мяса, производство рыбных гидролизатов
Протеаза Streptomyces griseus Производство детергентов, рыбных гидролизатов и мягчение мяса

Иммобилизованные протеазы можно использовать для свертыва­ния молока. Такой процесс необходимо проводить в два этапа - вы­держки продукта с ферментом и каогуляции. Только в этом случае достигается непрерывность процесса, так как при его одностадийно-сти образуются творожные сгустки вокруг частиц нерастворимого фер­мента, что затрудняет доступ к нему порции молока. На стадии вы-


держки предусматривается обработка последнего иммобилизованным ферментом при температуре ниже 15 °С. При таком режиме происхо­дит гидролиз к-казеина, но молоко не каогулирует. Это осуществля­ется после обработки ферментом в холоде нагреванием и термостати-рованием при температуре 37 °С. Процесс агрегации белков молока происходит после гидролиза 80%-го к-казеина. В России получены препараты химотрипсина, ковалентно связанного с КМ-целлюлозой, и модифицированного, сорбированного на анионитах. Они обладают до­статочно высокой активностью и испытаны на молокосвертывающую способность.

Положительные результаты дали также испытания сычужного фермента, иммобилизованного на поливинилспиртовых волокнах и включенного в гель альгината кальция при производстве сыра. Рео­логические показатели и характер пространственной структуры сгуст­ка были аналогичны при использовании иммобилизованного и сво­бодного сычужного ферментов. Однако для внедрения их в произ­водство необходимо решить проблему стерилизации стабилизирован­ных ферментных препаратов после нескольких циклов работы.

Лминоацилазы относятся к подклассу 3.5 и объединяют фер­менты, действующие на C-N-связи, отличающиеся от пептидных. Спо­собность аминоацилаз различать L- и D -аминокислоты используют в промышленности для производства последних и других, в том числе незаменимых. Получение оптически активных аминокислот разделе­нием их рацемических (оптически неактивных) смесей было одним из первых процессов, осуществленных с помощью иммобилизован­ных ферментов на промышленном уровне. Раньше он проводился с применением растворимого фермента — аминоацилазы, но был недо­статочно эффективным. После перехода на иммобилизованную амино-ацилазу его продуктивность возросла в 1,5 раза, и в настоящее время в Японии осуществляют на промышленномуровне производство боль-шинства незаменимых аминокислот.

Чтобы найти оптимальную форму иммобилизованного фермента для этого процесса, японские ученые провели обширные исследова­ния, результаты которых изложены в табл. 5.

Эти данные говорят о том, что для промышленного использования помимо начальной активности необходимо учитывать и многие дру­гие факторы. В данном случае исследователи остановились на ами-ноацилазе, иммобилизованной ионными связями на ДЭАЭ-сефадексе, в силу высокой активности, простоты получения, возможности регене­рации и устойчивости такого катализатора, который к тому же без какого-либо механического разрушения и снижения связывающей активности функционирует 5 лет.


Таблица 5

Свойства иммобилизованных различными методами аминоацилаз (субстрат — ацшнО,£,-метионин)

 

 

№ Свойства Нативная амино- ацилаза Иммобилизованная аминоацилаза
Ионное связывание с ДЭАЭ-сефа- дексом Ковалентное связывание с иодоацетил- целлюлозой Включение в ПААГ
Оптимальный рН 7,5 - 8,0 7,0 7,5 - 8,5 7,0
Оптимальная тем­пература, "С
Энергия реактива­ции, ккал/моль 6,9 7,0 3,9 5,3
Оптимальная кон­центрация Со2+, моль 0,5 0,5 0,5 0,5
Km, ммоль 5,7 8,7 6,7 5,0
V , мкмоль/ч max ' 1,5 3,3 4,6 2,3
Методика получе­ния   Простая Сложная Сложная
Связывающие силы   Слабые Сильные Сильные
Возможность регенерации   Возможна Невозможна Невозможна

Технологическая схема установки для получения L-аминокислот представлена на рис. 25.

В качестве исходного вещества используют ацилированные D-, L-аминокислоты (ацил-Д£-аминокислоты), полученные обычным хими­ческим синтезом. Их подвергают воздействию фермента аминоацила-зы, который гидролизует только один изомер, приводя к образованию незамещенной L -аминокислоты и оставляя нерасщепленной ацил-D-аминокислоту. Отщепление ацильной группы приводит к резкому увеличению растворимости L-аминокислоты, за счет этого аминокис­лоты легко отделить друг от друга, и выделяется чистая L-форма. Остающаяся ацил-D-аминокислота при нагревании рацемизируется, т. е. опять переходит в смесь ацилированных D,L-аминокислот, и процесс ферментации повторяют сначала. В итоге единственным про­дуктом является L-аминокислота. Причем для аминоацилазы не име­ет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь стро­ение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфич­ность.

Препарат иммобилизованной аминоацилазы готовили следующим


образом. 1 000 л ДЭАЭ-сефадекса перемешивали с 1 100 — 1 700 л водного раствора аминоацилазы при 35 °С и рН 7,0 в течение 10 ч. После фильтрации препарат промывали водой. Выход активности по отношению к первоначально растворенному ферменту составлял 55 — 60 %. Колонна с иммобилизованной аминоацилазой сохраняла более 60 % исходной активности после месяца работы. Регенерация катали­затора в колонне производится путем простого добавления свежего раствора фермента, который опять адсорбируется на носителе. Устой­чивость последнего составляет 5 — 8 лет.

кристаллы £-аминокислот

Рис. 25. Технологическая схема производства L-аминокислот

из рацемической смеси с применением иммобилизованной аминоацилазы:

1 — резервуар с исходной рацемической смесью; 2 — фильтр; 3 — теплообменник;

4 — биореактор с иммобилизованным ферментом; 5 — испаритель;

6 — кристаллизатор; 7 — сепаратор; 8 — рацемизатор

Пенициллинацидаза (пенициллинамидаза, ацилтрансфераза) относится к третьему классу, катализирует гидролиз боковых цепей пенициллинов и их производных, воздействуя на C-N-связь. Фермен­ты, выделенные из разных источников, имеют различные характери­стики субстратов, и это используется для классификации различных типов пенициллинамидаз. Имеются три их типа. Если фермент гид­ролизу ет специфический пенициллин V, то он обозначается типом I. Его можно встретить в грибах и бактериях. Ферменты типа II специ­фичны к пенициллину G и содержатся только в бактериях. КIII типу относят все пенициллинамидазы, катализирующие гидролиз амино-ациллинов и цефалоспоринов.

При ферментативном гидролизе пенициллинов и цефалоспоринов


образуются соответственно 6-аминопенициллановая (6-АПК) и 7-ами-поцефалоспориновая кислоты, которые затем используют для полу­чения полусинтетических антибиотиков. Различными компаниями производятся разные препараты иммобилизованной пенициллинами-дазы. По итальянской технологии их готовят смешиванием раствора фермента с триацетатом целлюлозы в хлористом метилене. Образую­щуюся эмульсию с ферментом далее подвергают экструзии в нити. Волокна триацетата целлюлозы, содержащие иммобилизованный фер­мент, размещают вдоль термостатируемой колонны. Общий выход со­ставляет 85 %.

В России на ОАО «Биохимик» для производства 6-АПК исполь­зуют пенициллинамидазу, включенную в полиакриламидный гель, мо­дифицированный глутаровым диальдегидом.

Лиазы. Лиазы относятся к четвертому классу, катализируют от­щепление от субстратов той или иной группы (не путем гидролиза) с образованием двойной связи или, наоборот, присоединение групп к двойным связям. Среди них наибольшее промышленное значение имеют ферменты, участвующие в реакциях синтеза аминокислот и других органических кислот.

Аспартаза (аспартатаммиаклиаза) катализирует реакцию син­теза L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты и аммиака. Этот фермент особенно активен у факультативных анаэробных бактерий. Содержится так5ке в бактероидах, находящихся в клубеньках бобо­вых растений.

Аспартаза катализирует реакцию присоединения аммиака по двой­ной связи фумаровой кислоты. Этот процесс не требует присутствия других кофакторов, кроме ионов двухвалентного магния. Фермент накапливается в клетках бактерий при росте культур на богатых сре­дах, содержащих мясной бульон, пептон, дрожжевой экстракт или на­бор большого числа аминокислот.

Получение L-аспарагиновой кислоты, растворимой и иммобилизо­ванной внутриклеточной аспартазой, оказалось неэкономичным в свя­зи с низкой стабильностью. Поэтому для этих целей используют це­лые клетки, включенные в полимерные гели, в частности, в Японии их включают в полиакриламидный гель (ПААГ). Время полуинактива­ции препарата при 37 °С составляет 120 дней (для сравнения: для иммобилизованной аспартазы — 30 дней). Для иммобилизации 10 кг влажных клеток суспендируют в 40 л физиологического раствора, добавляют 7,5 кг акриламида, 0,4 кг метиленбисакриламида, 5 л 5%-го диметиламинопропионитрила и 5 л 2,5%-го персульфата калия. Смесь оставляют на 10 — 15 мин и образующийся гель формируют в куби­ки размером 2 — 3 мм.

Исходным сырьем для синтеза L-аспарагиновой кислоты служит фумарат аммония. Его раствор в концентрации 1 моль/л, содержа­щий 0,001 моль/л хлористого аммония, пропускают при рН 8,5 и 37 °С через колонку с иммобилизованными клетками со скоростью


потока 0,6 об/ч. Значение рН, полученного на выходе 2 400 л раство­ра, доводят до 2,8 добавлением 60%-го раствора серной кислоты при температуре 90 °С, затем охлаждают до 15 °С и выдерживают 2 ч. Кристаллизирующуюся аспарагииовую кислоту собирают центрифу­гированием и промывают водой.

В России разработаны и испытаны на пилотной установке биока­тализаторы, полученные иммобилизацией клеток Е. coli-85 с аспар-тазной активностью в гель каррагенана и альгината кальция.

Фумараза (фумаратгидратаза) катализирует реакции синтеза из фумаровой кислоты и воды L-яблочной кислоты, которая находит применение в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевтических препаратах.

И в этой технологии используют клетки, только с фумаразной ак­тивностью, иммобилизованные в ПААГ. Для подавления побочной реакции образования янтарной кислоты, которая с трудом отделяется от иепрореагировавшей фумаровой кислоты, эти клетки обрабатыва­ют детергантами, например экстрактом желчных кислот, в концентра­ции 0,2 % при 37 °С, рН 7,5 в течение 20 ч. По сравнению с интактны-ми иммобилизованные клетки существенно стабильнее, и время их полуинактивации составляет около двух месяцев.

В Италии производят иммобилизованную фумаразу, где фермент включен в полые волокна триацетата целлюлозы с сохранением 40%-й активности.

Изомеразы. Изомеразы относятся к пятому классу ферментов, катализируют реакции изомеризации. Из них в промышленности -широкое применение нашла глюкозоизомераза. Существует несколь­ко типов изомераз, но не все они обладают подлинной глюкозоизоме-ризующей активностью. Практическое применение нашел только фер­мент D-ксилозокетоизомераза, КФ 5.3.1.5, применяющийся для про­изводства глюкозофруктозного сиропа (ГФС) и фруктозы. Это свя­зано с тем, что он не требует присутствия NAD+ в реакционной среде и обладает высокой термостабильностыо. В связи с практическим на­значением его называют глюкозоизомеразой (ГЛИ).

Фруктоза, или фруктовый (плодовый, медовый) сахар, по сравне­нию с обычным пищевым сахаром, в состав которого она также вхо­дит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой, об­ладает более приятным вкусом. Она на 70 % слаще сахара, и по­треблять ее можно в меньших количествах. Это очень важно для боль­ных сахарным диабетом, так как усвоение фруктозы не связано с ин­сулином. Сахар (сахарозу) нельзя заменить D-глюкозой, поскольку глюкоза менее сладкая. Этот недостаток можно устранить, если по­следнюю частично изомеризовать во фруктозу ГЛИ.

Во многих странах освоена технология получения эффективных иммобилизованных биокатализаторов с глюкозоизомеразной актив­ностью, многие из которых уже внедрены в производство. Наиболее известные препараты получены следующим образом: адсорбцией фер-


ментного экстракта на ДЕАЕ-целлюлозе или на пористом алюминии, или на ионообменных смолах; включением ферментного препарата в желатиновый гель с последующей сшивкой глутаровым диальдеги-дом или в полые волокна триацетата целлюлозы.

Для выбора типа иммобилизованного биокатализатора, конструк­ции реактора, условий каталитического процесса в реакторе необхо­димо проведение большой предварительной работы. Это хорошо вид­но на примере того, какие параметры исследовали американские уче­ные при внедрении в производство технологии получения кукурузно­го сиропа с высоким содержанием фруктозы с использованием иммо­билизованной ГЛИ.

Биохимические параметры включают: активность препарата; ста­бильность фермента (время жизни и полуинактивации); производи­тельность в используемом диапазоне времени жизни; оптимальную концентрацию субстрата; влияние концентрации субстрата; воздей­ствие концентрации олигосахаридов; влияние растворенного кисло­рода; минимальное и максимальное время контакта с субстратом; обра­зование побочных продуктов реакции; чувствительность к измене­нию рН и температуры; устойчивость при храпении; вымываемость фермента; рост микроорганизмов; характеристики потока на выходе (состав, цвет, запах, рН, содержание белков и т. д.).

К механическим параметрам относятся: размер, форма частиц и распределение по размерам; насыпная масса в сухом и влажном виде; набухание; сжимаемость; когезия; истирание частиц.

Гидромеханические параметры: перепад давления; тип потока (вос­ходящий или нисходящий); уплотнение слоя; осевая дисперсия и ка-налообразование; распределение времени пребывания; расслаивание; отношение длины к диаметру; минимальная скорость начала псевдо-ожижеиия.

В ходе анализа вышеприведенных параметров был выбран био­катализатор со следующими свойствами: форма катализатора — су­хие гранулы; внешний вид - окрашен в желто-коричневый цвет; объемная плотность в сухом состоянии — 0,64 — 0,72 г/см3; объем­ная плотность во влажном состоянии — 0,2 г/см3; характерный размер пор — 0,2 мкмоль; активность — не менее 0,04 ед./г; произ­водительность — до 907 кг 42%-го обогащенного фруктозой сиропа на 0,45 кг фермента в течение 1 000 ч; объем пустот в слое — 45 %.

Выбранный размер частиц биокатализатора удовлетворял двум взаимоисключающим требованиям: с одной стороны, эти частицы до­статочно малы, чтобы скорость диффузии не лимитировала скорость всего процесса, а с другой стороны, они велики, чтобы свести к мини­муму перепад давления на реакторе колонного типа со слоем иммо­билизованного фермента. Ниже приводятся оптимальные условия, вы­бранные экспериментальным путем: содержание сухого вещества — 40 — 45 %; глюкозы в исходной смеси — 93 — 96 %; требования к исходной смеси — ее необходимая очистка фильтрованием, обработ-


кой активированным углем и ионообменными смолами; рН — 8,2 — 8,5; допустимое падение рН - на 0,2 - 0,4; температура - 60 °С; активатор — 4 • 10 4 моль Mg2+; время контакта фермента с субстра­том — 0,5 — 4 ч.

Как следует из условий, для того чтобы процесс шел нормально, необходимо высокое содержание глюкозы в поступающей в реактор смеси. Если в ней доля олигосахаридов превышает 10 %, наблюдается снижение активности биокатализатора. Большой диапазон времени (0,5 — 4 ч) контакта последнего с субстратом объясняется постепен­ной его инактивацией. Активность фермента падает, и при постоянной скорости потока реагентов степень превращения субстрата постоянно снижается. Поэтому для обеспечения необходимого качества продук­ции по мере инактивации фермента время его контакта с субстратом увеличивают путем снижения скорости потока. Необходимо иметь в виду, что размеры реакторов колонного типа определяются гидроме­ханическими свойствами биокатализатора. При нисходящем движе­нии реакционной смеси слой иммобилизованного фермента может сжиматься под давлением, в результате этого сопротивление потоку падает. Учитывая известное время контакта биокатализатора с суб­стратом и заданную производительность всей установки, можно опре­делить размеры и количество колонных реакторов. В данном случае целесообразно установить несколько колонн, так чтобы они инактиви-ровались и заменялись последовательно, Это позволит максималь­ным образом использовать биокатализатор ив то же время обеспе­чить постоянно высокую производительность установки в целом. Тех­нологическая схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы, основанного на использовании им­мобилизованной ГЛИ, представлена на рис. 26. В данном случае для эффективной работы фермента необходимо множество операций пред­варительного разделения и обработки промежуточных продуктов между стадиями получения глюкозы из крахмала (осахаривания) и изомеризацией. Для повышения термической устойчивости а-амила-зы, применяемой для гидролиза крахмала при температуре 105 °С, добавляют ионы кальция, которые в свою очередь ингибируют ГЛИ, поэтому перед поступлением глюкозы в реактор изомеризации их удаляют из среды связыванием ионообменными смолами.

В России получен оригинальный иммобилизованный препарат клеток Streptomyces albogrisedus с глюкозоизомеразной активностью. Их иммобилизацию проводили путем включения в матрицу, состоя­щую из двух гелей — гидроокси Со2+ и хитозана. Термообработан-ные клетки влажностью 90 % суспендировали в 6 мл 3%-го раствора, приготовленного на основе 18%-го ацетата кобальта.

Смесь гомогенизировали и по каплям добавляли к 5%-му водному раствору аммиака. В качестве субстрата использовали 2 моля раство­ра глюкозы, содержащей 5 • 10"3моль MgS04 • 7Н20. Ионы кобальта выполняли роль стабилизатора. Испытания на пилотной установке в лабораторных условиях дали неплохие результаты.


глюкозофруктозный сироп

Рис. 26. Технологическая схема производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы: 1 — резервуар для ожижения и осахаривания крахмала; 2 — фильтр; 3 — резер­вуар для очистки активированным углем; 4 — ионообменник (связывание кальция); 5 — концентратор; 6 — резервуар для подготовки смеси; 7 — колонны с иммобили­зованными ферментами; 8 — резервуар для очистки активированным углем; 9 — катионообменник; 10 — анионообменник; 11 — резервуар для упаривания;

12 — резервуар для охлаждения

Оксидоредуктазы.Иммобилизованные ферменты этого класса по отдельности или в комплексе с другими ферментами используют для холодной стерилизации молока. Тепловая обработка оказывает отри­цательное воздействие на его органолептические свойства, особенно при хранении. Так, в молоке, предназначенном для сыроделия, после этого снижается способность казеина к свертыванию под действием сычужного фермента. Поэтому тепловая обработка в некоторых слу­чаях нежелательна и ее лучше заменить холодной стерилизацией. Существует два ее способа.


Первый способ заключается в воздействии на молоко каталазы с введением перекиси водорода. Так, эффект пастеризации продукта, предназначенного для производства сыра, может быть достигнут без нагревания обработкой 0,05%-м раствором перекиси водорода за счет разрушения последней каталазой и выделения атомарного кислорода. Применение иммобилизованной каталазы делает этот способ эконо­мически выгодным. Однако основным препятствием при ее использо­вании для холодной стерилизации является инактивация фермента перекисью водорода. Проблему можно решить заменой ферментов животного происхождения грибными, которые менее чувствительны к перекиси, либо созданием реакторов, оптимальных для данного про­цесса. Уже получены препараты иммобилизованной на аминокремне-земах каталазы гриба Penicillium vitale, которые характеризуются высокими каталитической активностью, рН и термостабилыюстыо при хранении. Период сохранения половины начальной активности ката­лазы, иммобилизованной на силохроме через углеводный компонент фермента, составляет 45 мес.

Второй способ холодной стерилизации заключается в использо­вании лактопероксидазной системы — лактопероксидазы-тоцшш-та — и непрерывно выделяющейся перекиси водорода. Промежуточ­ный продукт каталитического окисления тиоцианата под действием лактопероксидазы обладает антибактериальными свойствами. Моло­ко содержит все компоненты этой системы, кроме перекиси водорода. Введение последней можно обеспечить проведением соответствующих ферментативных реакций. Перекись водорода получают путем про­пускания сыворотки через колонну с иммобилизованными на пори­стом стекле ферментами р-галактозидазой и глюкозооксидазой. Этот способ позволяет обеспечить действие бактерицидной фазы в молоке при нейтральных значениях рН, что используется известной шведской фирмой «Альфа-Лаваль».