Ініціація трансляції в еукаріотів
Еукаріотична рибосома поза процесом трансляції також дисоційована на дві субодиниці, завдяки взаємодії маленької з фактором IF3 (складається з 9 – 11 субодиниць). Крім того, дисоційований стан субодиниць підтримується кількома іншими факторами, що взаємодіють з маленькою (eIF3С) і великою (eIF6) субодиницями. З комплексом маленька субодиниця – eIF3 зв’язується потрійнийкомплекс ініціаторна метіонінова тРНК – eIF2·GTP (eIF2 є аналогом фактора елонгації eEF1).
Рис. 28. Послідовність основних подій при ініціації трансляції в еукаріотів.
Паралельно (рис. 28) відбувається впізнання кепа на 5′-кінці мРНК факторами ініціації групи eIF4: субодиниця eIF4E зв’язуєтьсяз кепом, eIF4G є структурним модулем, що забезпечує цілісність комплексу та його взаємодію з іншими елементами ініціації, eIF4Aє АТР-залежною РНК-геліказою, фактор eIF4В (не показаний на рис. 28) взаємодіє з мРНК, стимулює АТР-азну активність гелікази і при скануванні мРНК бере участь у впізнанні стартового кодона.
Наступним кроком є об’єднання кеп-асоційованого комплексу з таким, що асоційований з маленькою субодиницею (ініціаторна тРНК має бути присутньою на маленькій субодиниці, щоб ця остання могла приєднатися до кепу). Ефективність утворення цього преініціаторного комплексу на кепі підсилюється за рахунок взаємодії polyA-зв’язаних білків (PABP) з eIF4G: polyA-послідовність на 3′-кінці мРНК також приєднується до преініціаторного комплексу, замикаючи мРНК у кільце. Далі за рахунок геліказної активності eIF4A преініціаторний комплекс (залишаючи на кепі лише eIF4E) починає транслокацію: eIF4A здійснює гідроліз АТР і пересувається вздовж мРНК у напрямку до 3′-кінця, одночасно руйнуючи дволанцюгові шпильки, якщо вони зустрічаються. Під час транслокації преініціаторний комплекс сканує послідовність мРНК, перевіряючи її на наявність стартового кодона.
Зовсім не обов’язково при цьому перший кодон AUG, що зустрічається, сприймається як стартовий. Упізнання стартового кодона залежить від контексту послідовності, в якій він розташований. Найкращим контекстом, який максимально сприяє ініціації трансляції, є так звана послідовність Козак (Marilyn Kozak): GCC(A/G)CCAUGG. Упізнання стартового кодона викликає відповідні конфірмаційні зміни комплексу, звільнення факторів eIF3 і eIF4 (останній повертається на кеп разом polyA-ділянкою мРНК), приєднання великої рибосомної субодиниці та дисоціацію eIF2·GDP після гідролізу GTP.
Дисоціація eIF3 і eIF2 полегшується фактором eIF5. Рибосома після цього вступає в етап елонгації трансляції, а на кепі починається збирання наступної рибосоми. Таким чином, на мРНК одночасно працює кілька рибосом, які утворюють так звану полісому (рис. 29). Зациклення полісоми: 1) сприяє залученню зруйнованої при термінації трансляції у 3′-кінцевій зоні мРНК рибосоми до нового раунду ініціації; 2) забезпечує додатковий захист 3′-кінця мРНК (унаслідок його взаємодії з кеп-асоційованим комплексом) від нуклеазної деградації; 3) підвищує надійність системи трансляції – оскільки деградація мРНК може розпочинатися тільки з 3′-кінця, лише повноцінні матриці, що містять polyA-послідовність (і автоматично – кодуючу частину) залучаються до білкового синтезу.
Рис. 29. Циркулярна полісома.
Термінація трансляції
Термінація білкового синтезу здійснюється за подібною для про- та еукаріотів схемою (рис. 30). Коли після чергового елонгаційного циклу (який стане останнім) в А-сайті опиняється один із трьох стоп-кодонів, він упізнається фактором термінації трансляції RF1 або RF2(RF – Release Factor) – жодна тРНК не містить відповідних антикодонів. Цей фактор рекрутує до рибосоми комплекс RF3·GTP (аналог EF1). Під дією останнього спрацьовує пептидил-трансферазний центр рибосоми, намагаючись здійснити перенесення пептидилу. Оскількив А-сайті немає звичайного субстрату транспептидації, відбувається перенесення на молекулу води – гідроліз зв’язку С-кінцевої амінокислоти з рибозою у складі пептидил-тРНК. На цьому закінчується власне термінація трансляції – з рибосоми звільняється поліпептид. Наступні події стосуються вже підготовки рибосоми до нового раунду трансляції.
Після гідролізу GTP здійснюється дисоціація факторів термінації та зв’язування замість них фактора відновлення рибосоми RRF (Ribosome Recycling Factor) і фактора елонгації EF2 в комплексі з GTP. Сумісна дія цих факторів у координації з гідролізом GTP спричиняє дисоціацію рибосомних субодиниць. Із маленькою субодиницею замість дисоційованих RRF і EF2 зв’язується фактор ініціації трансляції IF3(який, таким чином, можна вважати також і фактором термінації). IF3 сприяє визволенню тРНК і мРНК з маленької субодиниці й запобігає взаємодії між субодиницями. У результаті субодиниці рибосоми знов можуть залучитися до ініціації трансляції.
Рис. 30. Послідовність основних подій при термінації трансляції.
Регуляція трансляції
Прокаріотична мРНК має досить невеликий час життя – практично вона існує під час транскрипції та відразу після неї. Регуляція експресії гена у прокаріотів здійснюється переважно на рівні транскрипції (хоча білковий синтез може бути залученим до такої регуляції). Для еукаріотів регуляція трансляції є, навпаки, дуже важливим окремим елементом загальної регуляції експресії.
Регуляція на рівні ініціації трансляції – це один із найважливіших механізмів. Ефективність ініціації трансляції залежить насамперед від:
• Контексту послідовності, в якій знаходиться стартовий кодон – відхилення цього контексту від послідовності Козак (див. вище) утруднює впізнання стартової точки і, відповідно, зумовлює необхідність позитивної регуляції.
• Відстані стартового кодона від 5′-кінця мРНК – довге сканування матриці під час ініціації підвищує ймовірність руйнування преініціаторного комплексу.
• Наявності / відсутності дволанцюгових шпильок у 5′-кінцевій зоні мРНК, що не транслюється, які гальмують процес сканування.
• Присутності / відсутності регуляторних білків, які зв’язуютьсяу 5′-кінцевій зоні. Крім того, у деяких випадках (РНК пікорнавірусів, мРНК факторів росту фібробластів) процес ініціації відбувається за ефективним внутрішнім механізмом незалежно від сканування: завдяки наявності особливих послідовностей (IRES – Internal Ribosome Entry Site), що безпосередньо впізнаються елементами системи ініціації.
Один із прикладів участі білків у негативній регуляції ініціації трансляції наведено на рис. 31. Білок, який утримує залізо в клітині – феритин – має з’являтися негайно після проникнення в цитоплазму цього необхідного, але отруйного у вільному вигляді мікроелемента. Тому мРНК феритину завжди міститься в цитоплазмі, у відсутності заліза – у неактивному стані. Інактивація забезпечується за рахунок зв’язування репресора (який блокує процес сканування) зі шпилькою у 5′-кінцевій зоні.
Рис. 31. Регуляція синтезу феритину.
Як репресор виступає аконітаза (один із ферментів циклу Кребса (Hans Adolf Krebs)). При появі заліза воно зв’язується аконітазою, що викликає звільнення аконітази від мРНК і, як наслідок, активацію трансляції феритину. Синтезований феритин зв’язує залізо, забираючи його в аконітази, яка повертається на мРНК і зупиняє трансляцію.
Мішенню глобальної регуляції на рівні ініціації є також фактори ініціації. Наприклад, фосфорилювання / дефосфорилювання eIF2 приводить, відповідно, до його деактивації / активації. Крім регуляторних білків, до регуляції трансляції залучаються також маленькі РНК. Серед них є такі, що мають стимулюючий вплив на трансляцію: РНК деяких вірусів, РНК продукти транскрипції Alu-повторів гальмують фосфорилювання eIF2, сприяючи активації трансляції. Молекули мікроРНК, навпаки, гальмують трансляцію (частіше на етапі сканування матриці) за рахунок комплементарної взаємодії з мРНК.
Елонгація трансляції також є мішенню регуляторних впливів. Швидкість елонгації варіює в досить широких межах відносно середнього значення, іноді рибосома може зупинятися на певний час. Паузи відбуваються на кодонах, які відповідають мінорним тРНК, зміна концентрації яких є одним зі шляхів регуляції швидкості трансляції. Підвищення загальної швидкості трансляції пов’язане з адаптацією наборів аа-тРНК – узгодженням між частотою найуживаніших кодонів і відповідних ізоакцепторних тРНК. Наявність шпильок усередині кодуючої частини мРНК також гальмує елонгацію, як і репресори, які впізнають елементи послідовності мРНК.
Однією з мішеней регуляції є також фактори елонгації, котрі (як і фактори ініціації) піддаються певним модифікаціям, що зумовлюють активацію / інактивацію факторів. Екстремальний приклад – дифтерійний токсин, який інактивує фактор eEF2 і повністю вимикає білковий синтез. Особливим випадком є включення в кілька важливих білків (присутні в усіх організмів ферменти, що належать до класу оксидоредуктаз) модифікованої амінокислоти селеноцистеїну (яка є елементом активного центру цих ферментів). Селеноцистеїнова тРНК (продукт особливого тРНКгена) здатна впізнавати внутрішній стоп-кодон UGA, фланкований (у напрямку до 3′-кінця) специфічною шпилькою. Ця тРНК спочатку акцептує Ser, який далі перетворюється на селеноцистеїн відповідними ферментами (відбувається заміна ОН-групи на групуSeH).
Селеноцистеїн-тРНК зв’язується зі специфічним аналогом елонгаційного фактора EF1 (позначається як SelB у прокаріотів і як SECIS в еукаріотів). Шпилька в мРНК упізнається або самим цим специфічним фактором елонгації (прокаріоти), або ще одним білком, з яким цей фактор елонгації взаємодіє (еукаріоти), що й забезпечує зв’язування селеноцистеїн-тРНК з А-сайтом рибосоми.
Зміна часу життя мРНК – ще один шлях регуляції трансляції. Час життя мРНК у цитоплазмі залежить головним чином від ступеня захищеності 3′-кінця від екзонуклеаз (оскільки кеп є нечутливим до нуклеаз). Досить типову ситуацію ілюструє приклад регуляції трансляції іншого білка, який має відношення до обміну заліза, – рецептора трансферину (рис. 32).
Рис. 32. Регуляція синтезу рецептора трансферину.
Трансферин є позаклітинним переносником заліза, транспорт заліза в цитоплазму залежить від кількості рецепторів трансферину в мембрані. У відсутності заліза всередині клітини на мРНК рецептора здійснюється синтез білка, мРНК при цьому стабілізована: аконітаза зв’язана зі шпильками в 3′-кінцевій зоні, що блокує нуклеазну деградацію. Зростання концентрації заліза викликає дисоціацію аконітази, і починається швидка деградація мРНК.