Направления использования PCR
Диагностика болезней (DNA-диагностика). Метод основан на том, что первичная структура DNA разных видов организмов различна. Значит, можно найти последовательности, характерные для DNA возбудителей болезни и подобрать такие праймеры, которые будут гибридизоваться с DNA возбудителя, но не с DNA человека. В этом случае продуктом амплификации будет DNA только возбудителя, а не пациента.
Изучение генома человека. Для этого необходимо выделение и амплификация отдельных генов. Используются праймеры, комплементарные началу изучаемого гена. Последовательность нуклеотидов в таком праймере можно определить по аминокислотной последовательности N-конца и С-конца соответствующего белка и таблице кода. Трудность заключается в том, что код вырожденный и приходится синтезировать несколько праймеров, а затем опытным путем находить праймеры, комплементарные концам гена. Выделение и анализ отдельных фрагментов генов используется для определения мутации и диагностики наследственных болезней.
Клонирование генов
Фрагменты DNA можно вырезать из генома эукариот специально подобранными рестриктазами и встраивать в DNA плазмиды или вируса вскрытую (разрезанную) теми же рестриктазами. Образуется гибридная плазмида или рекомбинантная DNA. Однако таким способом получается очень небольшое количество рекомбинантной DNA. Клонирование - это способ ее накопления. Для этого рекомбинантные плазмиды встраивают в бактерии и получают рекомбинантные бактерии, которые реплицируют, транскрибируют и транслируют «чужие» гены.
Получение рекомбинантной DNA
Из бактериальной массы можно выделить достаточное количество рекомбинантной DNA.
Схема синтеза препроинсулина в трансформированных клетках E.Coli.
Плазмиды кольцевые, двухцепочечные молекулы DNA, содержащиеся в бактериальных клетках и способные к репликации и транскрипции, независимо от клеточных хромосом.
Обратная транскриптаза (RNA-зависимая DNA-полимераза) - фермент, катализирующий синтез DNA, используя в качестве матрицы RNA. Этот фермент необходим для получения последовательности DNA, комплементарной mRNA (kDNA), применяемой в генной инженерии. С помощью обратной транскриптазы можно получить kDNA- копии mRNA, в которой отсутствуют интроны. Следовательно, при включении в плазмиды эта молекула не подвергается сплайсингу. Рекомбинантные микроорганизмы нашли практическое применение как продуценты необходимых человеку веществ: белковых гормонов, биологически активных пептидов.
Белки иммунной системы
Иммунная система человека - это согласованно функционирующая система молекул и клеток, распознающих и удаляющих чужеродные вещества. За иммунитет отвечают В- и Т-клетки. В-клетки вырабатывают антитела - иммуноглобулины (Ig). Т-клетки могут убивать чужеродные клетки или собственные, инфицированные вирусом, и могут быть регуляторами иммунного ответа. Каждая молекула антитела представляет собой белок, имеющий форму буквы Y и состоящий из двух идентичных тяжелых (H) цепей и двух идентичных легких (L) цепей.
Строение иммуноглобулинов: а - пептидные цепи иммуно-глобулинов (Н - тяжелые, L - легкие); пунктиром обозначены вариабельные области; б - молекула IgM, пять мономеров связаны дисульфидными связями; в - комплексы антиген-антитело.
Существует пять классов антител, имеющих различные константные области Н-цепи. С любым типом Н-цепей могут быть связаны L-цепи любого типа. Каждая L- и Н-цепь Ig состоит из вариабельной области на N-конце и расположенной за ней константной области. Вариабельность аминокислотной последовательности N-концевых участков, как Н - так и L-цепей обеспечивает структурную основу для разнообразия антигенсвязывающих участков. Н-цепи образуют Fc-область («хвостовую») антител. Разные Н-цепи придают «хвостовым» областям антител различную конформацию, от которой зависит дальнейшая судьба комплекса антиген-антитело. От того, с какими белками будет связываться Fс-область Н-цепей, зависят свойства и функции данного класса Ig. Fc-область Ig может связываться не только с фагоцитирующими клетками, но и с первым компонентом системы комплемента, в результате чего активируется та особая система белков крови, которая способствует разрушению антигена.
Разнообразие антител - результат транспозиции генов. Все В-лимфоциты организма образуют большое число клонов, которые синтезируют антитела только одного вида - имеющие одинаковые вариабельные области. Антиген, присоединяясь к лимфоцитам соответствующего клона, вызывает пролиферацию этого клона и активирует синтез и секрецию антител клетками этого клона. В предшественниках лимфоцитов гены, кодирующие разные области пептидных цепей антител, расположены в разных частях молекулы DNA. При дифференцировке лимфоцитов в процессе онтогенеза происходит рекомбинация - перенос генов из одного места в другое в пределах молекулы DNA (транспозиция). DNA, определяющая вариабельные области антител, составлена из примерно 400 генов V, около 20 генов D и 4 генов J. В результате транспозиции объединяются 3 гена V, D и J в полный ген вариабельной области, который соединяется с любым из генов константной области, и получается полный ген тяжелой цепи. Сходным путем образуются и гены легких цепей антител. Таким способом возникают миллионы разных генов, ответственных за синтез антител.