Методы выделения кумаринов
Для выделения кумаринов из растительного сырья обычно применяются различные растворители: метиловый, этиловый спирт, бензол, хлороформ, этиловый и петролейный эфиры.
Наиболее полная экстракция кумаринов как свободных, так и связанных (гликозидов) достигается этиловым спиртом. После отгонки спирта, полученный густой экстракт чаще всего обрабатывают растворителями: хлороформом, этиловым эфиром.
В некоторых случаях целесообразно растительный материал предварительно обрабатывать петролейным эфиром, а затем экстрагировать хлороформом, этиловым, метиловым спиртом.
С целью отделения кумаринов от сопутствующих веществ и выделения суммы кумаринов часто сконцентрированный экстракт из растительного сырья обрабатывают 0,5% водным раствором КОН для удаления кислых и фенольных компонентов. Затем экстракт обрабатывается 5% водно-спиртовым раствором КОН в течение 1 часа. При этом кумарины образуют соли кумариновых кислот. Одновременно происходят и другие реакции: омыление жиров и других сложных эфиров. Водно-щелочной раствор подкисляется разбавленной НСl. При этом освобождаются органические кислоты, а присутствующие кумариновые кислоты переходят в кумарины. Смесь кислот и кумаринов извлекается этиловым эфиром (многократное повторное встряхивание). Кислые составные части удаляют добавлением по каплям 0,5% водной щелочи в раствор, в то время кумарины как более устойчивые по отношению к разбавленной щелочи остаются в этиловом эфире.
Для очистки кумаринов от сопутствующих веществ и для выделения индивидуальных соединений широкое использование получили хроматографические методы. В качестве сорбента при хроматографировании кумаринов чаще всего используется оксид алюминия и силикагель. Кумарины хорошо элюируются с колонки смесью петролейного эфира с хлороформом, бензолом, смесью бензола с этилацетатом, смесью бензола с метиловым спиртом (в различных соотношениях). Эфирные масла, глицериды, стероиды, тритерпены обычно появляются в первых фракциях элюата, затем следуют кумарины. Кумарины на колонке и в элюатах обнаруживаются по флуоресценции в УФ свете. Проведение хроматографического разделения кумаринов на колонке облегчается применением бумажной и тонкослойной хроматографии для качественного анализа элюатов. Методы бумажной и тонкослойной хроматографии позволяют быстро устанавливать однородность элюата, обнаружив даже незначительные количества примесей.
Качественный анализ сырья на содержание кумаринов
Для обнаружения кумаринов в растительном сырье используют реакцию размыкания и замыкания лактонного кольца, способность давать окрашенные растворы с диазосоединениями, микросублимацию, способность флюоресцировать при УФ освещении и хроматографический анализ спиртовых или хлороформных экстрактов сырья.
Для проведения бумажной хроматографии в качестве подвижной фазы используют бензин, петролейный эфир, смесь гексан-бензол-метиловый спирт (5:4:1). В качестве неподвижной фазы – 20% водный раствор пропиленгликоля или этиленгликоля, 10% формамид в метиловом спирте. Как правило, неподвижной фазой предварительно пропитывается хроматографическая бумага. Хроматографирование осуществляется нисходящим способом в течение 1,5 – 2 часов. Хроматограммы после высушивания просматривают в УФ свете. Кумарины в зависимости от структуры имеют голубую, синюю, фиолетовую, зеленую, желтую флуоресценцию, флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают и хроматограммы обрабатывают щелочью. После этого их высушивают в сушильном шкафу при t = 120ºС и вновь просматривают под УФ, как правило, флуоресценция усиливается. Затем хроматограмму обрабатывают диазореактивом, от действия которого кумарины в зависимости от структуры окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый, фиолетовый цвета. В некоторых случаях после просматривания хроматограммы в УФ свете её обрабатывают реактивом Драгендорфа или парами иода. Кумарины проявляются в виде пятен, окрашенных в коричневый цвет.
Помимо бумажной хроматографии широко используется метод тонкослойной хроматографии. Хроматография проводится в тонком слое оксида алюминия или силикагеля. Хорошее разделение кумаринов в тонком слое было достигнуто при применении следующих систем растворителей: этилацетат – бензол (1:2); хлороформ – петролейный эфир (1:2).
Проявление кумаринов на хроматограммах проводится точно так же, как в случае проявления бумажных хроматограмм.
Методики качественного анализа. 2 г измельченного сырья (плоды амми большой, пастернака посевного, псоралеи костянковой, корней горичника и порезника густоцветного и др.) заливают 20 мл этилового спирта и кипятят в течение 15 мин. с обратным холодильником. После охлаждения фильтруют.
Качественные реакции. 1. К 3-5 мл спиртового извлечения прибавляют 10 капель 10% KOH в метиловом спирте и нагревают в течение 5 мин на водяной бане (при наличии кумаринов раствор желтеет), затем прибавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива Паули по Кутачеку. При наличии кумаринов раствор приобретает окрашивание от коричнево-красного до вишневого.
2. К 3-5 мл спиртового извлечения добавляют 10 капель 10% KOH в метиловом спирте; раствор нагревают на водяной бане. Затем добавляют 5-10 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают, после чего раствор нейтрализуют 10% HCl до кислой реакции. Если при этом наблюдается помутнение или выпадение осадка, то это указывает на вероятное присутствие кумаринов в сырье (лактонная проба).
Хроматографическое определение. 3а. Из оставшейся части спиртового извлечения берут 0,01 мл и наносят на пластинку «Силуфол» или селикагеля и хроматографируют в системе н-гексан – бензол – метиловый спирт (5:4:1) до тех пор, пока линия фронта не достигнет расстояния 10 см от линии старта. После этого хроматограмму высушивают на воздухе в течение 10 мин, опрыскивают 10% KOH в метаноле и высушивают в сушильном шкафу при t = 110 – 120ºC в течение 2-3 мин. Затем опрыскивают свежеприготовленным реактивом Паули по Кутачеку. При наличии кумаринов в сырье на хроматограмме проявляются яркие пятна от кирпично-красного до сине-фиолетового окрашивания в зависимости от структуры кумаринов.
3б. 0,01 мл спиртового извлечения наносят на полосу хроматографической бумаги марки «Б» размером 14×65 см, предварительно импрегнированной 10% формамидом в метиловом спирте, и хроматографируют нисходящим методом в смеси растворителей петролейный эфир – бензол – метиловый спирт (5:4:1) в течение 3 – 4 часов. Хроматограмму высушивают на воздухе в течение 10 мин, опрыскивают 10% KOH в метиловом спирте и высушивают в сушильном шкафу при t = 110 -120ºС в течение 2-3 мин, затем опрыскивают диазореактивом Паули по Кутачеку. При наличии кумаринов в сырье на хроматограмме появляются яркие пятна от кирпично-красного до сине-фиолетового окрашивания.