Непрямой иммунофлюоресцентный метод

Метод основан на поэтапном выявлении комплексов антиген-антитело с помощью флюоресцентных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов при соединении бактериальных (или вирусных) антигенов со специфическими антибактериальными и противовирусными сыворотками. Второй этап - выявление этого комплекса путем обработки его меченым антигамма-глобулином. Иными словами, препарат, содержащий антиген (например, холерный) сначала обрабатывают специфической (противохолерной) сывороткой. Затем препарат обрабатывают меченой флюорохромом антиглобулиновой сывороткой (содержит антитела против глобулинов). Учитывая, что диагностические антибактериальные сыворотки, как правило, получают путем иммунизации кроликов бактериальными антигенами, применяются люминесцирующие антиглобулиновые сыворотки, содержащие антитела к глобулинам кролика. Такую сыворотку можно получить от лошадей, иммунизированных кроличьей сывороткой.

В тех случаях, если антиген соответствует антителам специфической сыворотки, на первом этапе реакции образуется специфический комплекс антиген-антитело. При последующем добавлении антиглобулиновой сыворотки, содержащиеся в ней антитела к глобулинам кролика тоже присоединяются к этому комплексу, так как они фактически являются антителами антител специфической сыворотки, применявшейся на первом этапе. А так как антиглобулиновая сыворотка мечена флюорохромом, образующиеся комплексы ярко светятся при люминесцентной микроскопии.

Непрямой метод сложнее в постановке, чем прямой, но зато он обладает более высокой чувствительностью. Другое его неоспоримое преимущество - он более доступен, так как с помощью одной и той же антивидовой меченой сыворотки можно выявить различные бактериальные антигены, применяя в каждом случае соответствующую видовую немеченую специфическую иммунную сыворотку. Так, имея набор немаркированных специфических иммунных сывороток кроликов к различным вирусным, бактериальным антигенам и единую меченую гамма-глобулиновую фракцию лошадиной сыворотки, можно осуществлять диагностику многих инфекционных заболеваний с помощью иммунофлюоресцентного метода.

Иммуноферментный анализ

В основу метода положено свойство антител соединяться с ферментом. Это соединение не приводит к утрате ни специфичности антител, ни каталитической активности ферментов. Ферментные метки - это белковые молекулы, обладающие чрезвычайно мощным каталитическим действием. Ничтожно малые дозы фермента можно выявить и определить их количества по катализируемой ими реакции. В качестве ферментных меток наиболее часто используют: пероксидазу, щелочную фосфатазу, глюкозоксидазу. Для их выявления применяют специфические субстраты (для каждого фермента есть свой субстрат). При наличии фермента субстрат изменяет свою окраску, и это регистрируется визуально или при помощи спектрофотоколориметра. В качестве субстратов применяются: перекись водорода, ортодианизидин, паранитрофенилфосфат, паранитэофенил. На сегодняшний день известно большое число вариантов иммуноферментного метода. Наиболее широкое применение на практике нашел вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Суть его в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксирован на твердом носителе, к нему последовательно добавляются другие компоненты реакций в жидкой фазе. В качестве твердых носителей используются изготовленные из синтетических инертных материалов (полистирола, дакрила, метакрила, поливинилхлорида и др.) панели, шарики, пробирки. После соединения антигена с антителами этот образовавшийся комплекс путем промывания можно легко отделить от несвязавшихся компонентов реакции. Метод основан на последовательном взаимодействии фиксированных на твердой фазе антигенов (или антител)со специфическими антителами (антигенами), а затем - и с иммуноферментными конъюгатами, представляющими собой меченые ферментом антитела против иммуноглобулинов.

ИФА имеет следующие преимущества перед другими серологическими методами:

1) метод является универсальным, так как позволяет определить любое соединение, против которого получены специфические антитела;

2) меченые соединения устойчивы и сохраняют свою специфическую активность при длительном хранении;

3) ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью;

4) его результаты можно оценивать визуально, без применения специальной аппаратуры.

ИФА применяется для определения как антител, так и антигенов. В зависимости от применяемой модификации ИФА различают следующие варианты методов: прямой, непрямой, конкурентный.

Прямой метод ИФА

Данный метод называют еще "сэндвич-методом". Он применяется для сероидентификации. В данном случав известным компонентом реакции, являются антитела, фиксированные на твердой фазе. Вначале в лунки, к поверхности которых фиксированы антитела (антитела-1), добавляют исследуемый антигенсодержащий материал. После определенного инкубирования отмывают содержимое лунок, в результате чего несвязавшийся антиген удаляется. Затем в лунки помещают избыток антител, специфичных к данному антигену и меченых ферментом (антитела-2 + фермент), снова отмывают и добавляют субстрат для фермента. По истечении определенного времени останавливают реакцию внесением специфического реагента и учитывают результат визуально или по показаниям спектрофотометра. Если анализируемый антиген окажется специфичным по отношению к сорбированным на носителе антителам, то произойдет образование комплекса антитела-1 + антиген + антитела-2 + фермент; тот комплекс будет фиксирован на твердой фазе и не удалится при промываниях лунок. Для выявления фермента к смеси добавляют субстрат, который отщепляет этот фермент, что проявляется изменением окраски реагирующих смесей. Если же анализируемый антиген окажется неспецифичным по отношению к сорбированным на носителе антителам, то несвязавшийся антиген и меченые антитела будут удалены из системы во время отмывок, и внесение субстрата не вызовет изменения окраски содержимого лунок пластиковой пластины.

Непрямой метод ИФА

Непрямой метод чаще используется для серодиагностики. В таком случае известным компонентом реакции являются антигены, фиксированные на твердой фазе. В лунки вносится исследуемая сыворотка больного человека (неизвестные антитела). После инкубации в течение некоторого времени, позволяющего связаться антигенам со специфическими антителами, проводится отмывка содержимого лунок. Если антигены соответствуют исследуемым антителам, образуется их соединение, и комплекс антиген-антитело оказывается фиксированным к поверхности лунок. Затем в лунки добавляют меченую ферментом антиглобулиновую сыворотку. Эти антитела специфически связываются с белками сыворотки обследуемого человека, так как являются антителами к этим белкам. Образуется так называемый "сэндвич": антигены + антитела сыворотки + антиглобулин, меченый ферментом. После очередной отмывки в лунки вносится субстрат, который делает реакцию видимой (изменяется цвет жидкости в лунках). Результаты реакции более точно определяются фотометрически - они оцениваются по интенсивности изменения цвета среды с помощью специальных приборов - фотоколориметров.

Радиоиммунный анализ

В 1960 г. Ялод и Берсон разработали и внедрили в практику метод определения концентрации инсулина в плазме крови человека с использованием радиоактивной метки; он оказался приемлемым для количественного определения и других гормонов.

Эти исследования показали необычайно высокую чувствительность метода, позволяющего выявить незначительные количества инсулина, меченого радиоактивным йодом, по их связыванию с соответствующими антителами.

В дальнейшем предложенный радиоиммунный анализ (РИА) навел широкое применение в иммунологических исследованиях с целью выявления различных по природе антигенов или антител.

Характерной особенностью радиоиммунологическйх методов является использование антигенов или антител с радиоактивной меткой. Для получения последних радиоактивные изотопы (14с, 125J, Зн, 32р и другие) вводятся в состав антигенов или антител.

На сегодняшний день существует много вариантов постановки реакции с мечеными радиоизотопами антигенами или антителами.

С целью серодиагностики возможно применение прямого варианта РИА.

Aг * I¹³⁵+ Aт →

радиоактивный стандартный исследуемая

диагностикум с известной сыворотка

радиоактивностью (R₁)

Aг * I¹³⁵─Aт +Aг * I¹³⁵

комплекс надосадочная жидкость

с радиоактивностью (R₂)

Образовавшийся комплекс отделяют от оставшегося свободным меченого антигена (R₂). Затем с помощью счетчика определяют радиоактивность несвязавшегося меченого антигена. Если R₁› R₂, реакция считается положительной. Разница R₁- R₂ указывает на точное количество содержание искомого антитела.

С целью сероидентификации применяют конкурентный РИА. При этом в реакции участвуют стандартный меченый антиген и определяемый немеченый антиген, которые как бы конкурирует за места связывания специфических антител стандартной иммунной сыворотки до наступления момента достижения равновесия всех компонентов реакционной смеси.

Для оценки полученных результатов отделяют образовавшиеся комплексы антиген-антитела (фильтрованием, центрифугированием) и с помощью счетчика определяют их радиоактивность. Концентрация исследуемого антигена в анализируемых пробах устанавливается путем вычисления радиоактивности анализируемых проб и в контрольных образцах, где используются стандартные антигены и антитела.

1 проба:

Aг * I^{135 +}Aт → Aг * I¹³⁵─Aт

меченый стандартный специфическая комплекс с радио

диагностикум иммунная сыворотка активностью (R₁)

2 проба:

Aг + Aт + Aг * I¹³⁵

исследуемый специфическая меченый стандартный

неизвестный диагностическая диагностикум

иммунная сыворотка

Aг ─ Aт ─ Aг * I¹³⁵+ Aг * I¹³⁵

комплекс с радиоактив- свободный, несвязавшийся,

ностью (R₂) отмывается

Образовавшиеся комплексы отделяют от свободного, оставшегося несвязанным меченого антигена. Затем с помощью счетчика определяют и сравнивают радиоактивности образовавшихся комплексов R₁ и R₂ .Если R₁› R₂ - реакция считается положительной. Разница R₁- R₂ указывает на точное количественное содержание искомого антигена.

Недостатки ИФА - сложности, связанные с получением высокоочищенных антигенов и с необходимостью создания безопасных условий при работе с радиоактивными веществами.

Иммуноблотинг

Иммуноблотинг - метод идентификации антигенов или антител сочетающий в себе:

а) электрофоретическое разделение сложной смеси биологических макромолекул (антигенов или антител) с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;

б) перенос разделенных белковых макромолекул из геля на твердую подложку (агарозу, диазобумагу, нитроцеллюлёзный фильтр);

в) выявление на твердой подложке перенесенных белков с помощью ИФА, РИА, РИФ.

Данный метод позволяет получать результаты, отличающиеся высоким качеством с точки зрения разрешающей способности, чувствительности и достоверности.

Приведенные данные свидетельствует о большом разнообразии серологических методов исследования, применяемых при диагностике бактериальных инфекции. Значение этих методов для практической медицины трудно переоценить. Возможности серологии чрезвычайно велики. Серологические реакции помогают установить этиологию заболеваний, изучить патогенез, позволяют проследить какой путь проходят возбудители в организме больного и какова динамика накопления специфических антител; они с успехом применяются для решения важнейших практических задач профлактики и терапии многих заболеваний