Биосистемы, объекты и методы в биотехнологии

Одним из терминов в биотехнологии является понятие «биосисте­мы». Обобщенные характеристики биологической (живой) системы могут быть сведены к трём присущим им основным признаками:

1. Живые системы являются гетерогенными открытыми система­ми, которые обмениваются с окружающей средой веществами и энер­гией.

2. Эти системы являются самоуправляемыми, саморегулирующими, идактивными, т.е. способными к обмену информацией с окружа­ющей средой для поддержания своей структуры и управления про­цессами метаболизма.

3. Живые системы являются самовоспроизводящимися (клетки, организмы).

По структуре биосистемы делятся на элементы (подсистемы), свя­занные между собой, и характеризуются сложной организацией (ато­мы, молекулы, органеллы, клетки, организмы, популяции, сообще­ства).

Управление в клетке представляет собой сочетание процессов синтеза молекул белков-ферментов, необходимых для осуществления той или иной функции, и непрерывных процессов изменения активно­сти в ходе взаимодействия триплетных кодов ДНК в ядре и макромо­лекул в рибосомах. Усиление и торможение ферментативной актив­ности происходит в зависимости от количества начальных и конеч­ных продуктов соответствующих биохимических реакций. Благода­ря этой сложной организации биосистемы отличаются от всех нежи­вых объектов.

Поведение биосистемы является совокупностью ее реакций в от­вет на внешние воздействия, т.е. наиболее общей задачей управляю­щих систем живых организмов является сохранение его энергетиче­ской основы при изменяющихся условиях внешней среды.

Н.М. Амосов делит все биосистемы на пять иерархических уров­ней сложности: одноклеточные организмы, многоклеточные организ­мы, популяции, биогеоценоз и биосферу.

Одноклеточные организмы - это вирусы, бактерии и простейшие. Функции одноклеточных - обмен веществом и энергией со средой, рост и деление, реакции на внешние раздражители в виде изменения обмена и формы движения. Все функции одноклеточных поддержива­ются за счет биохимических процессов ферментативной природы и за счет энергетического обмена - начиная от способа получения энер­гии и до синтеза новых структур или расщепления существующих. Единственным механизмом одноклеточных, обеспечивающим их приспособление к окружающей среде, является механизм изменений в отдельных генах ДНК и, как следствие, изменение белков-фермен­тов и изменение биохимических реакций.

Основой системного подхода к анализу структур биосистем является ее представление в виде двух компонентов - энергетической и управляющей.

Основным, элементом является энергетическая составляющая, обозначенная через МС (ме­таболическая система), и управляющая, обозначенная через Р (генетическое и физиологическое управле­ние) и передающая сигналы управле­ния на эффекторы (Э). Одной из главных функций метаболической системы является снабжение биосистем энер­гией.

Структура биосистем поддерживается механизмами генетическо­го управления. Получая от остальных систем энергию и информацию в виде продуктов обмена веществ (матаболитов), а в период формиро­вания - в виде гормонов, генетическая система управляет процессом синтеза необходимых веществ и поддерживает жизнедеятельность остальных систем организма, причем процессы в этой системе про­текают достаточно медленно.

Несмотря на многообразие биосистем, отношения между их био­логическими свойствами остаются инвариантными для всех организ­мов. В сложной системе возможности к адаптации значительно боль­ше, чем в простой. В простой системе эти функции обеспечиваются малым количеством механизмов, при этом они более чувствительны к изменениям во внешней среде.

Для биосистем характерна качественная неоднородность, прояв­ляющаяся в том, что в рамках одной и той же функциональной био­системы совместно и слаженно работают подсистемы с качественно различными адекватными управляющими сигналами (химическими, физическими, информационными).

Иерархичность биосистем проявляется в постепенном усложнении функции на одном уровне иерархии и скачкообразном переходе к качественно другой функции на следующем уровне иерархии, а также в специфическом построении различных биосистем, их ана­лиза и управления в такой последовательности, что итоговая выход­ная функция нижележащего уровня иерархии входит в качестве эле­мента в вышележащий уровень.

Постоянное приспособление к среде и эволюция невозможны без единства двух противоположных свойств: структурно-функциональ­ной организованности и структурно-функциональной вероятности, стохастичности и изменчивости.

Структурно-функциональная организованность проявляется на всех уровнях биосистем и характеризуется высокой устойчивостью биологического вида и его формы. На уровне макромолекул это свой­ство обеспечивается репликацией макромолекул, на уровне клетки -делением, на уровне особи и популяции - воспроизведением особей путем размножения.

В качестве биологических объектов или систем, которые исполь­зует биотехнология, прежде всего необходимо назвать одноклеточ­ные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки. Выбор этих объектов обусловлен следующими моментами:

1. Клетки являются своего рода «биофабриками», вырабатываю­щими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продук­ты: белки, жиры, углеводы, витамины, нуклеиновые кислоты, ами­нокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр. Многие из этих продуктов, крайне необходимые в жиз­ни человека, пока недоступны для получения «небиотехнологическими» способами из-за дефицитности или высокой стоимости сырья
или же сложности технологических процессов;

2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериаль­ная клетка делится через каждые 20 - 60 мин, дрожжевая – через каждые 1,5 - 2 ч, животная - через 24 ч, что позволяет за относитель­но короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешё­вых и недефицитных питательных средах в промышленных масшта­бах огромные количества биомассы микробных, животных или рас­тительных клеток. Например, в биореакторе ёмкостью 100 м3 за 2 – 3 сут можно вырастить 10'6- 1018микробных клеток. В процессе жиз­недеятельности клеток при их выращивании в среду поступает боль­шое количество ценных продуктов, а сами клетки представляют со­бой кладовые этих продуктов;

3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др. значительно экономичнее и технологичес­ки доступнее, чем химический синтез. При этом исходное сырьё для биосинтеза, как правило, проще и доступнее, чем сырьё для других
видов синтеза. Для биосинтеза используют отходы сельскохозяй­ственной, рыбной продукции, пищевой промышленности, рас­тительное сырьё (молочная сыворотка, дрожжи, древесина, меласса и др.)

4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего техно­логического оборудования, доступность сырья, технологии перера­ботки и т.д.

Таким образом, природа дала в руки исследователям живую сис­тему, содержащую и синтезирующую уникальные компоненты, и, в первую очередь, нуклеиновые кислоты, с открытием которых и на­чала бурно развиваться биотехнология и мировая наука в целом.

Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, протозойные организмы, клетки (ткани) растений, животных и чело­века, вещества биологического происхождения (например, ферменты, простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты), молекулы.

В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии относят­ся либо к микроорганизмам, либо к растительным и животным клет­кам. В свою очередь организм можно охарактеризовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, целенаправленного синте­за, устойчиво и активно протекающего при оптимальном под­держании всех необходимых параметров.

Методы, применяемые в биотехнологии, определяются двумя уровнями: клеточным и молекулярным. Тот и другой определяются биобъектами.

В первом случае дело имеют с бактериальными клетками (для получения вакцинных препаратов), актиномицетов (при получении антибиотиков), микромицетов (при получении лимонной кислоты), животных клеток (при изготовлении противовирусных вакцин), кле­ток человека (при изготовлении интерферона) и др.

Во втором случае дело имеют с молекулами, например с нуклеи­новыми кислотами. Однако в конечной стадии молекулярный уро­вень трансформируется в клеточный. Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляции и диссимиляции) образуют новые продукты и выделяют метаболиты разнообразного физико-химичес­кого состава и биологического действия.

При росте клетки в ней осуществляется огромное число катали­зируемых ферментами реакций, в результате которых образуются промежуточные соединения, которые в свою очередь превращаются в структуры клетки. К промежуточным соединениям, к строитель­ным «кирпичикам» относятся 20 аминокислот, 4 рибонуклеотида, 4 дезоксирибонуклеотида, 10 витаминов, моносахара, жирные кисло­ты, гексозамины. Из этих «кирпичиков» строятся «блоки»: пример­но 2000 белков, ДНК, три типа РНК, полисахариды, липиды, фер­менты. Образующиеся «блоки» идут на строительство клеточных структур: ядро, рибосомы, мембрана, клеточная стенка, митохонд­рии, жгутики и пр., из которых состоит клетка.

На каждой стадии «биологического синтеза» клетки можно опре­делить те продукты, которые могут быть использованы в биотехно­логии.

Обычно продукты одноклеточных делят на 4 категории:

а) сами клетки как источник целевого продукта. Например, выра­щенные бактерии или вирусы используют для получения живой или убитой корпускулярной вакцины; дрожжи, как кормовой белок или основу для получения гидролизатов питательных сред и т.д.;

б) крупные молекулы, которые синтезируются клетками в процессе выращивания: ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;

в) первичные метаболиты - низкомолекулярные вещества (менее 1500 дальтон), необходимые для роста клеток, такие как аминокис­лоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты;

г) вторичные метаболиты (идиолиты) - низкомолекулярные со­единения, не требующиеся для роста клеток: антибиотики, алкалои­ды, токсины, гормоны.

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырьё, ко­торое в результате технологической обработки превращается в ко­нечный, пригодный для использования продукт.

Все микрообъекты, используемые в биотехнологии, относят к акариотам, про- или к эукариотам. Из группы эукариот, например, опе­рирует в качестве биообъектов клетками простейших, водорослей и грибов, из группы прокариот - клетками сине-зеленых водорослей и бактерий, акариот – вирусами.

Биообъекты из микромира варьируют в размерах от нанометров (вирусы, бактериофаги) до миллиметров и сантиметров (гигантские водоросли) и характеризуются относительно быстрым темпом раз­множения. В современной Фарминдустрии используется гигантская гамма биообъектов, группировка которых весьма сложна и лучше всего может быть выполнена на основе принципа их соразмерности.

Огромная совокупность биобъектов не исчерпывает всей элемен­тной базы, которой оперирует биотехнология. Последние успехи биологии и генной инженерии привели к появлению совершенно новых биообъектов – трансгенных (генетически-модифицированных) бактерий, вирусов, грибов, клеток растений, животных, человека и химер.

Несмотря на то, что представители всех надцарств содержат ге­нетический материал, различные акариоты лишены какого-либо од­ного типа нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК). Они не способны функционировать (в том числе - реплицироваться) вне живой клет­ки, и, следовательно, правомочно именовать их безъядерными. Па­разитизм вирусов развивается на генетическом уровне.

Бактерии имеют ленточную организацию и у них имеются нукле­иновые кислоты обоих типов - РНК и ДНК, из которых ДНК пред­ставлена в виде одиночной (кольцевидной) хромосомы. Большинство из них размножается на питательных средах (вне организма), а если среди бактерий и есть безусловные (облигатные) паразиты, прибли­жающиеся по данному признаку к вирусам (хламидии, микоплазмы, риккетсии), то паразитизм их отличается по своему механизму - его можно назвать клеточным.

При целенаправленном обследовании различных экологических ниш выявляются все новые группы микроорганизмов-продуцентов полезных веществ, которые могут быть использованы в биотехноло­гии. Количество видов микроорганизмов, используемых в биотехно­логии, постоянно растет.

При выборе биологического объекта во всех случаях нужно со­блюдать принцип технологичности. Так, если в течение многочис­ленных циклов культивирования свойства биологического объекта не сохраняются или претерпевают существенные изменения, то дан­ный биологический объект следует признать нетехнологичным, т.е. неприемлемым для следующих после стадии лабораторных иссле­дований технологических разработок.

С развитием биотехнологии огромное значение приобретают спе­циализированные банки биологических объектов, в частности кол­лекции микроорганизмов с изученными свойствами, а также криобанки клеток животных и растений, которые уже сейчас с помощью специальных методов могут быть с успехом использованы для кон­струирования новых, полезных для биотехнологии организмов. По сути дела, такие специализированные банки культур ответственны за сохранение чрезвычайно ценного генофонда.

Коллекции культур играют важную роль в процедуре правовой защиты новых культур и в стандартизации биотехнологических про­цессов. В коллекциях проводится сохранение, поддержание и обес­печение микроорганизмов штаммами, плазмидами, фагами, линия­ми клеток как для научных и прикладных исследований, так для и соответствующих производств. Коллекции культур кроме основной задачи - обеспечения жизнеспособности и сохранения генетических свойств штаммов - содействуют развитию научных исследований (в области таксономии, цитологии, физиологии), а также служат целям обучения. Они выполняют незаменимую функцию в качестве депо­зитариев патентуемых штаммов. Согласно международным прави­лам, патентоваться и депозитироваться могут не только эффектив­ные продуценты, но и культуры, используемые в генетической инже­нерии.

Большое внимание ученые уделяют целенаправленному созданию новых, не существующих в природе биологических объектов. В пер­вую очередь, следует отметить создание новых клеток микроорганиз­мов, растений, животных методами генетической инженерии. Созданию новых биологических объектов, безусловно, способствует со­вершенствование правовой охраны изобретений в области генетичес­кой инженерии и биотехнологии в целом. Сформировалось направле­ние, занимающееся конструированием искусственных клеток. В на­стоящее время существуют методы, позволяющие получить искусст­венные клетки с использованием различных синтетических и биоло­гических материалов, например искусственной клеточной мембра­ны с заданной проницаемостью и поверхностными свойствами. Неко­торые материалы могут быть заключены внутри таких клеток: фер­ментные системы, клеточные экстракты, биологические клетки, маг­нитные материалы, изотопы, антитела, антигены, гормоны и др. При­менение искусственных клеток дало положительные результаты в производстве интерферонов и моноклональных антител, при создании иммуносорбентов и др.

Разрабатываются подходы к созданию искусственных ферментов и аналогов ферментов, обладающих повышенной стабильностью и активностью. Например, проводится синтез полипептидов желаемой стереоконфигурации, ведутся поиски методов направленного мута­генеза с целью замены одной аминокислоты на другую в молекуле фермента. Делаются попытки построения неферментных каталити­ческих моделей.

Как наиболее перспективные следует выделить следующие груп­пы биологических объектов:

- рекомбинанты, т.е. организмы, полученные методами гене­тической инженерии;

- растительные и животные тканевые клетки;

- термофильные микроорганизмы и ферменты;

- анаэробные организмы;

- ассоциации для превращения сложных субстратов;

- иммобилизованные биологические объекты.

Процесс искусственного создания биологического объекта (мик­роорганизма, или тканевой клетки) состоит в изменении его генети­ческой информации с целью исключить нежелательные и усилить нужные свойства или придать ему совершенно новые качества. Наи­более целенаправленные изменения можно выполнить путем реком­бинаций - перераспределяя гены или части генов и объединяя в од­ном организме генетическую информацию от двух и более организ­мов. Получение рекомбинантных организмов, в частности, можно осуществить методом слияния протопластов, путем переноса при­родных плазмид и методами генной инженерии.

К нетрадиционным биологическим агентам на данном этапе раз­вития биотехнологии относятся растительные и животные тканевые клетки, в том числе гибридомы, трансплантаты. Культуры клеток мле­копитающих уже сейчас являются продуцентами интерферона и ви­русных вакцин, в недалеком будущем осуществится крупномасштаб­ное получение моноклональных антител, поверхностных антигенов клеток человека, ангиогенных факторов.

С развитием методов биотехнологии все большее внимание будет уделяться использованию термофильных микроорганизмов и их ферментов.

Ферменты, продуцируемые термофильными микроорганизмами, характеризуются термостабильностью и более высокой устойчи­востью к денатурации по сравнению с ферментами из мезофилов. Проведение биотехнологических процессов при повышенной тем­пературе с использованием ферментов термофильных микроорга­низмов обладает рядом достоинств:

1) увеличивается скорость реакции;

2) повышается растворимость реактивов и за счет этого - продук­тивность процесса;

3) уменьшается возможность микробного заражения реакцион­ной среды.

Наблюдается возрождение биотехнологических процессов с ис­пользованием анаэробных микроорганизмов, которые нередко яв­ляются также термофильными. Анаэробные процессы привлекают внимание исследователей в связи с недостатком энергии и возмож­ностью получения биогаза. Так как при анаэробном культивировании не нужна аэрация среды и биохимические процессы менее интен­сивны, упрощается система теплоотвода, анаэробные процессы можно рассматривать как энергосберегающие.

Анаэробные микроорганизмы успешно используются для пере­работки отходов (биомассы растений, отходов пищевой промыш­ленности, бытовых отходов и др.) и стоков (бытовые и промышлен­ные стоки, навоз) в биогаз.

В последние годы расширяется применение смешанных куль­тур микроорганизмов и их природных ассоциаций. В реальной био­логической ситуации в природе микроорганизмы существуют в виде сообществ различных популяций, тесно связанных между со­бой и осуществляющих круговорот веществ в природе.

Основные преимущества смешанных культур по сравнению с монокультурами следующие:

- способность утилизировать сложные, неоднородные по со­ставу субстраты, зачастую непригодные для монокультур;

- способность к минерализации сложных органических соеди­нений;

- повышенная способность к биотрансформации органических веществ;

- повышенная устойчивость к токсичным веществам, в том чис­ле тяжелым металлам;

- повышенная устойчивость к воздействию окружающей среды;

- повышенная продуктивность;

- возможный обмен генетической информацией между отдель­ными видами сообщества.

Следует особо выделить такую группу биологических объектов, как ферменты-катализаторы биологического происхождения, изуче­нием которых в прикладном аспекте занимается инженерная энзимология. Основная ее задача - разработка биотехнологических про­цессов, в которых используется каталитическое действие энзимов, как правило, выделенных из состава биологических систем или находящихся внутри клеток, искусственно лишенных способнос­ти роста. Благодаря ферментам скорость реакций по сравнению с реакциями, протекающими в отсутствие этих катализаторов, возрастает в 10б- 1012раз.

Как отдельную отрасль создания и использования биологических объектов следует выделить иммобилизованные биологические объек­ты. Иммобилизованный объект представляет собой гармоничную систему, действие которой в целом определяется правильным подбо­ром трех основных компонентов: биологического объекта, носителя и способа связывания объекта с носителем.

В основном используются следующие группы методов мобилиза­ции биологических объектов:

- включение в гели, микрокапсулы;

- адсорбция на нерастворимых носителях;

- ковалентное связывание с носителем;

- сшивка бифункциональными реагентами без использования но­сителя;

- «самоагрегация» в случае интактных клеток.

Основными преимуществами использования иммобилизованных биологических объектов являются:

- высокая активность;

- возможность контроля за микроокружением агента;

возможность полного и быстрого отделения целевых продук­тов;

- возможность организации непрерывных процессов с многократ­ным использованием объекта.

Как следует из вышеизложенного, в биотехнологичиеских про­цессах возможно использование ряда биологических объектов, ха­рактеризующихся различными уровнями сложности биологической регуляции, например клеточным, субклеточным, молекулярным. От особенностей конкретного биологического объекта самым непос­редственным образом зависит подход к созданию всей биотехноло­гической системы в целом.

В результате фундаментальных биологических исследований уг­лубляются и расширяются знания о природе и, тем самым, о воз­можностях прикладного использования той или иной биологичес­кой системы в качестве активного начала биотехнологического процесса. Набор биологических объектов непрерывно пополняется.