Пересадка эмбрионов реципиентам
В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донора отбирают 5–6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племенными кондициями.
Основным условием хорошего приживления эмбрионов служит синхронность проявления половой охоты у доноров и реципиентов.
Разница во времени в проявлении половой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные же результаты получаются при разнице не более 12 часов. При современном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионы сразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим и нехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый период эмбрионального развития – имплантационный.
При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса, место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно. Эффективность хирургического способа пересадки эмбриона составляет 60–70%, а число телят – 3–4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середины 70-х годов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживается сложностью проведения операций в производственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, и невозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10–15 лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом. При нехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основаны на одном принципе – введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль за реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты. Для установления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главным образом путем ректальной пальпации.
Важным звеном селекционно-племенной работы является достоверность установления истинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов от генетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить по группам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4 недель до 4 месяцев.
Существенной причиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, является возможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщение результатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, что эффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будет введен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.
Однако на этот счет имеется и другая точка зрения: что конструкция приборов существенно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Эти результаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора, качеством и стадией развития эмбрионов. В целом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионов обеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50–60%, а применение маточных релаксантов перед пересадкой – до 75%. Это существенно выше, чем при хирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходна с искусственным осеменением коров и продолжается 3–5 минут, или 15–20 пересадок в час. Особого внимания заслуживает приём, заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией). Результаты проведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадка дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выход новорожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен составляет в среднем 55–60%, вместо 2% при естественном многоплодии коров. Можно пересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но в контрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняя приживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической подсадке составляет 50%. Обобщая результаты экспериментов по нехирургическому методу пересадки эмбрионов, можно придти к заключению, что пересадка двух эмбрионов в два рога матки реципиента или подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральный рог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологии трансплантации эмбрионов (П.Б. Завертяев, 1999).
Хранение эмбрионов
После оценки на жизнеспособность эмбрионы дважды промывают в фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением антибиотиков, засасывающих в минипайету вместе с небольшим количеством среды. Для пересадки используют в первые 2–4 ч после извлечения из половых путей донора.
Необходимость сохранения жизнеспособности эмбрионов более продолжительное время возникает в случаях: отсутствия достаточного количества подходящих реципиентов; сомнительного качества вымытых эмбрионов; создание банка эмбрионов для осуществления долгосрочных селекционных программ; обмена генофондом между странами и континентами на коммерческой основе.
Существует несколько способов хранения эмбрионов: кратковременное вне организма, кратковременное в организме, долговременное в сжиженных газах.
При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов вне организма был использован опыт культивирования тканей и клеток. Наиболее подходящей средой оказалась ТСМ 199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крови оленей. Эмбрионы хранят в атмосфере обогащенной углекислым газом, при постоянной температуре 37 градусов. В таких условиях они остаются жизнеспособными 24–48 ч. Имеются сообщения о том, что снижение температуры до 10 градусов позволяет продлить их жизнеспособность до 5–6 суток.
На протяжении 3–4 суток эмбрионы можно хранить в яйцепроводах крольчих, выживаемость составляет в средне 73%. В настоящее время этот способ не применяется.
На сегодня известно 2 способа глубокого замораживания эмбрионов: в программируемом режиме (ступенчатое замораживание); одномоментный (витрификация).
При замораживании по первому способу отобранные эмбрионы (отличного и хорошего качества) последовательно проводят через растворы криопротектера (глицерин или диметилсульфоксид) возрастающих концентраций, приготовленные на фосфатно-буферном солевом растворе Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки. После этого эмбрионы переносят в пробирки или ампулы (по 1–4 в каждую) вместе с 0,3 – 0,4 мл среды с криопротектором. Емкости с эмбрионами герметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают) и помещают в камеры замораживателя, где охлаждают до -7 градусов в режиме 1 градус в минуту. После достижения указанной температуры вызывают кристаллизацию среды. Для этого в жидком азоте пинцетом касаются стенки пробирки(ампулы) в зоне верхнего края столбика среды. Дальнейшее охлаждение (до -28 градусов или -35) ведут со скоростью 0,5 градуса в минуту, затем скорость уменьшают до 0,1 градус в минуту; через 10 минут доводят до конечной температуры погружением в жидкий азот.
Одномоментное замораживание (витрификация) – отвердение при чрезвычайно высокой вязкости среды, что ведет к образованию стекловидных структур. Это возможно при высокой концентрации криопротектора и быстром охлаждении.
Замораживают быстрым методом в минипайетах емкостью 0,25 мл в пайету, последовательно засасывают 0,5 М раствор сахарозы, воздух, 1,0 М раствор глицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствор сахарозы. Концы закрывают с обеих сторон пластиковыми пробками. После эквилибрации пайету, содержащую эмбрион, выдерживают 5 мин в парах жидкого азота, затем опускают в сосуд с жидким азотом (Н.И. Полянцев, 2001).
Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.
Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами.
По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. После герметизации емкости с эмбрионами ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждение от -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10–12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.
Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.
Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет (И.Р. Чернева, 2007).
Заключение
Разведение крупного рогатого скота молочных пород с помощью трансплантации эмбрионов позволяет: обеспечить размножение высокоценных племенных быков-производителей; формировать поголовье
заводских семейств; усилить давление по отбору быков-производителей, дочерей – трансплантантов, повысить генетический тренд по селекционным
признакам.
Сравнение молочной продуктивности дочерей быков – трансплантантов и их сверстников, полученных путем искусственного осеменения показало, что удой первых оказался более высоким по сравнению с дочерьми быков от искусственного осеменения.
Применение метода трансплантации эмбрионов в заводских семействах от высокоценных коров-доноров сокращает сроки их формирования в 1,5 раза по сравнению с искусственным осеменением за счет получения большего числа потомков.
Возможность увеличения численности полученных путем трансплантации высокоценных ремонтных быков за одинаковые воспроизводительные циклы быков – воспроизводящих коров и увеличить число быков, получающих племенные категории после проверки по качеству потомства в 4 раза. В закрытом нуклеусном стаде сокращается срок воспроизведения животных через лучшую его часть поголовья почти в 3 раза.
Расчет затрат на получение одного высокоценного ремонтного быка методом трансплантации из отечественных эмбрионов показал, что они в 2,2
раза больше по сравнению с расходами на искусственное осеменение, но
меньше в 5,4 раза, чем на покупку быка из-за рубежа и в 3,5 раза, чем на приобретение эмбрионов за пределами страны (И.Р. Чернева, 2007).
Список литературы
1. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. – Л.: «Агропромиздат», 1999.
2. Никитин В.Я., Г.П. Дюльгер, А.М. Петров, В.В. Храмцов, О.Н. Преображенский. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике репродукции животных. Москва, 2014. – 330 с.
3. Полянцев Н.И., Подберезный В.В. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных. Ростов н/Д.: Феникс, 2001. – 480 с.
4. Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. – Л.: «Наука», 1998.
5. Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения. – 7-е изд., перераб. и доп. – М.: Колос, 1999. – 495 с.
6. Чернева И.Р. Лекции по биотехнологии и пересадке эмбрионов. Московская ветеринарная академия им. Скрябина, 2007.