Метаболизм азотистых веществ
Для размножения дрожжей и необходимого для этого строительства нового клеточного вещества дрожжам требуется азот. В начальной фазе брожения низкомолекулярные пептиды гидролизуются и утилизируются дрожжами. Во время основной стадии брожения главный, но не единственный источник азота составляют аминокислоты. Дипептиды перерабатываются медленнее, чем аминокислоты. В конце брожения даже при наличии аминокислот вновь начинается ассимиляция пептидов. Аминокислоты важны не только для биосинтеза протеинов дрожжей, но и для образования пермеаз и других ферментов. В сусле для создания необходимых условий для размножения дрожжей и протекания брожения в нужном направлении должно содержаться достаточное количество аминокислот и пептидов.
3.2.2.1. Усвоение аминокислот дрожжами происходит с помощью пермеаз в определенной последовательности. Через некоторое время, за которое дрожжи потребляют половину количества каждой аминокислоты, их можно разделить на четыре группы:
· группа А: глютаминовая и аспараги-новая кислоты, аспарагин, глютамин, се-рин, треонин, лизин, аргинин;
· группа Б: валин, метионин, лейцин, изолейцин, гистидин;
· группа В: глицин, фенилаланин, тирозин, триптофан, аланин, аммиак;
· группа Г: пролин.
Если первые три группы абсорбируются довольно быстро, то пролин дрожжи практически не усваивают. Деление на эти группы действует для дрожжей верхового брожения; для дрожжей низового брожения хотя и имеет место аналогичное распределение аминокислот по группам, в исследованных дрожжах выявлено более позднее усвоение валила и гистидина и наблюдается нестабильное поведение аргинина.
На последовательность усвоения аминокислот оказывают влияние системы пермеаз. Первоначально усвоенная универсальная аминокислота пермеаза (УАП) во время первой стадии брожения еще не синтезируется, так как в сусле еще присутствуют ионы аммония. Аминокислоты группы А и, вероятно, группы Б характеризуются более специфичными транспортными системами, чем УАП. После усвоения ионов аммония из сусла образуется УАП, и все аминокислоты за исключением одной аминокислоты группы Г (пролина) усваиваются по этой транспортной системе дрожжевой клеткой. Выяснилось, однако, что на эффективность абсорбции аминокислот пермеазами влияет состав жирных кислот фосфолипидов в мембране цитоплазмы дрожжевой клетки. Этот состав жирных кислот в ходе брожения изменяется, причем отсутствие кислорода способствует строительству клеточных мембран со все увеличивающейся долей остатков насыщенных жирных кислот, которые при наличии ненасыщенных жирных кислот сусла также потребляются для строительства клеточных стенок. При их дефиците эффективная аэрация может даже вызвать синтез ненасыщенных кислот из насыщенных.
Процесс усвоения аминокислот во время брожения таким образом проходит многопланово, однако при брожении потребление аминного азота зависит не столько от содержания какой-либо отдельной аминокислоты, а скорее от общего содержания ассимилируемого азота.
3.2.2.2. Вместе с тем значение отдельных аминокислот важно и само по себе. Аминокислоты в значительном объеме ассимилируются в ненарушенном состоянии, однако в результате трансаминировання дрожжами они преобразуются в такие аминокислоты, которые именно в этот момент времени наиболее необходимы для строительства клеточного белка. Для этого служат не только углеродные каркасы аминокислот, но и каркасы простых Сахаров, оксикислоты которых при окислительном метаболизме углеводов образуются как промежуточные продукты реакции (например, α-кетоглутаровая кислота в фазе 15 дает глютаминовую кислоту, щавелево-уксусная кислота - аспарагиновую, а пировиноградная кислота - аланин). В связи с этим одни аминокислоты, α-кетокислоты которых важны для синтеза аминокислот, должны присутствовать в достаточном количестве, тогда как другие, несмотря на их вклад в содержание общего ассимилируемого азота, не столь важны. Лизин, гистидин, агринин и лейцин продуцируют оксикислоты, которые могут ассимилироваться только определенными аминокислотами субстрата. Нехватка этих аминокислот может изменить белковый обмен дрожжей и отрицательно повлиять на качество пива. Концентрация изолейцина, валина, фенилаланина, глицина, аланина и тирозина в сусле важна из-за того, что на более поздних стадиях брожения подавляется синтез Сахаров из акетокислот.
При этом они должны извлекаться из углеродного каркаса соответствующих аминокислот. С другой стороны, слишком низкое их содержание может отрицательно влиять на качество пива. Третья группа аминокислот для метаболизма дрожжей имеет небольшое значение: аспарагиновая к и с л о т а , глютаминовая кислота, аспарагинн, глютамин, треонин, серии и метионин на первых стадиях брожения извлекаются преимущественно из углеродных каркасов аминокислот, а на последней стадии - из кетокислот Сахаров.
К этой группе можно отнести и пролин, так как его концентрация большого значения не имеет.
Дефицит указанных групп аминокислот проявляется в усиленном использовании α-кетокислот углеводного метаболизма. Оксикислоты, высвобождающиеся при этом путем дезаминирования аминокислот, декарбоксилируют в альдегид, который имеет на один атом углерода меньше, чем первоначальная кетокислота, и затем восстанавливаются до спирта (механизм Эрлиха). Это приводит к увеличению содержания высших спиртов и тем самым оказывает влияние на качество пива (см. раздел 7.4.2.2). Избыток аминокислот также вызывает усиленное образование побочных продуктов (см. раздел 3.2.6).
3.2.2.3. Метаболизм азотистых веществ при брожении. В 12 %-ном сусле, приготовленном только из солода, содержится около 1000 мг азота/л. Несоложеное сырье (рис и кукуруза) вызывает снижение содержания азота, причем около 60 % приходится на долю низкомолекулярного азота; α-аминный азот составляет 20-23 %, то есть в сусле из соложеного зерна - 200-260 мг/л.
Снижение содержания азота при нормальном брожении составляет 250-320 мг/л, и таким образом в пиве, как правило, остается еще от 680 до 750 мг/л азота. Основное снижение содержания азота происходит вследствие его усвоения дрожжами, включающего не только α-аминный азот, но и низкомолекулярные пептиды. Содержание осаминного азота уменьшается на 100-120 мг/л. Из-за снижения значения pH в ходе брожения 50-70 мг высокомолекулярных азотистых веществ/л выпадают в осадок, адсорбируются на поверхности дрожжей или захватываются пузырьками углекислого газа и переходят шапку пены (деку). Дрожжи, однако, не только потребляют азотистые вещества, но и вновь выделяют часть из них в виде аминокислот и пептидов. С учетом этого количества азота дрожжи перерабатывают около 40 % азота сусла.
Метаболизм жиров
Липиды дрожжей вместе с белком образуют клеточные мембраны дрожжей. При этом речь идет о фосфолипи-дах, стеринах (эргостерине, цимостерине), гликолипидах и др. Липиды составляют около 80 % CB клеточных стенок. Так как масса дрожжей во время брожения увеличивается в 4 - 6 раз, то наряду с белком должны быть синтезированы и липиды, для чего требуется молекулярный кислород.
3.2.3.1. Образование жирных кислот начинается с активирования уксусной кислоты, образующейся при окислительном декарбоксилировании пирувата. Путем конденсации ацетилкоА и нескольких молекул малонилкоА в процессе синтеза жирных кислот образуются насыщенные жирные кислоты. Ненасыщенные жирные кислоты образуются путем дегидрирования насыщенных жирных кислот с одинаковой длиной цепочек при участии НАДФ H2 и молекулярного кислорода. При этом возможно формирование только одной двойной связи (между 8-м и 9-м атомами углерода). На синтез жирных кислот положительно влияют фосфаты, магний, биотип и пантотеновая кислота.
3.2.3.2. Значение жирных кислот в метаболизме дрожжей. Высокомолекулярные ненасыщенные жирные кислоты, присутствующие в клеточной стенке в виде липидов, в частности стерин (например, эргостерин), способствуют усвоению питательных веществ в растворенной или диспергированной форме. При недостатке таких липидов поглощение аминного азота становится невозможным, даже если в сусле содержится достаточное количество аминокислот. Транспортировка фосфата через клеточную мембрану также зависит от содержания в ней липидов. Кроме того, ненасыщенными жирными кислотами активируются важные для реакций фосфорилирования АТФ-ферменты. Таким образом, липиды в той или иной степени важны для основного пути расщепления глюкозы по схеме Эмбдена-Мейергофа-Парнаса.
Существенное влияние жирных кислот на процессы, происходящие во время брожения, свидетельствует о том, что в клетке должно присутствовать некоторое минимальное число ненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот. Они могут быть внесены с суслом, что, однако, в последующем вызывает проблемы со стабильностью вкуса пива. Стимулировать синтез этих жирных кислот необходимо за счет хорошего снабжения кислородом в начале брожения.
В сусле также присутствуют насыщенные и ненасыщенные среднемолекулярные жирные кислоты (C6-C12). Они также участвуют в процессе метаболизма дрожжей, причем С2-фрагмеиты используются через ацетил-коА и малонил-коА для синтеза высокомолекулярных жирных кислот.
3.23.3. Жирные кислоты и образование сложных эфиров. Образование сложных эфиров в ходе брожения (см. раздел 3.2.6.2) может подавляться повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот в сусле. С их помощью образуется больше клеточной массы дрожжей, что обусловливает утилизацию богатых энергией соединений в виде кофермента А, которого затем не хватает для образования сложних эфиров. В некоторых условиях, однако, насыщенные кислоты могут оказывать обратное действие - например, стеариновая и пальмитиновая кислоты в форме коА-комплексов способны выступать в качестве ингибитора синтеза жирных кислот. Ненасыщенные жирные кислоты снижают также образование среднемолекулярных жирных кислот (по-видимому, этот механизм сходен с вышеописанным).
3.2.3.4. Синтез глицерина основан на расщеплении углеводов (схема Эмб-дена-Мейергофа-Парнаса, фаза 4). Образующийся при этом диоксиацетонфосфат восстанавливается с помощью НАДН в глицеринфосфат и фосфоэстеразой переводится в глицерин. Глицерин, образующийся при расщеплении жиров, наоборот, вводится в анаэробный углеводный обмен. Свободные жирные кислоты окисляются до CO2 и воды, однако степень этой реакции зависит от степени расщепления углеводов.