Определение глюкоамилазной активности (поляриметрический экспресс-метод)

Аппаратура и реактивы: пробирки с притертыми крышками, водяная баня,мальтоза, 5 Н раствор соляной кислоты.

Порядок выполнения работы

Метод основан на определении скорости гидролиза мальтозы глюкоамилазой. Скорость измеряется поляриметрическим способом.

Мальтоза не атакуется a - амилазой, поэтому глюкоза, образовавшаяся в процессе реакции, является единственным продуктом действия глюкоамилазы на мальтозу, а изменение величины угла вращения плоскости поляризации этого сахара в реакционной среде характеризует активность глюкоамилазы.

За единицу активности глюкоамилазы принимается такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля мальтозы при температуре 50±0,1 ⁰С и рН 4,7 в течение 1 мин.

Результаты определения активности фермента глюкоамилазы поляриметрическим методом можно также выражать в единицах стандартного глюкозооксидазного метода.

В этом случае за единицу активности глюкоамилазы принимается такое количество фермента, которое за 1 мин при температуре 30±0,1 ⁰С и рН 4,7 образует из крахмала 1 мкмоль глюкозы.

Культуральную жидкость фильтруют, добиваясь прозрачности, затем разбавляют водой: Глюкаваморин Гх-466 5-100 мл до 100 мл, Глюкоэндомикопсин Гх 5-10 мл до 50 мл., ультраконцентрат Глюкаваморина Г18х-466 5 мл до 250 – 500 мл.

Рабочий раствор поверхностной культуры готовят, как солодовую вытяжку.

Испытуемые растворы глюкоамилазы должны обеспечивать величину П от 0,5 до 2,0 ⁰ нормальной сахарной шкалы.

В две пробирки (для проведения параллельных определений) вводят по 25 мл 2%-ного раствора мальтозы и помещают их в водяную баню при 50±0,1⁰С на 10 мин для прогревания. Затем приливают по 5 мл ферментного раствора, энергично перемешивают и выдерживают точно 15 мин в водяной бане при 50±0,1 ⁰С, вынимают и добавляют 1 мл 5 н. раствора соляной кислоты, а затем 5 мл исследуемого раствора фермента.

Опытные и контрольный растворы охлаждают до комнатной температуры и определяют угол вращения плоскости поляризации, используя трубку длиной 200 мм на сахариметре. Если поляриметр с круговой шкалой, то

П⁰сах = П⁰круг. /0,3462 (14)

шкала шкала

Если исходный ферментный препарат был мутным, то гидролизаты следует осветлять, добавляя 1 мл 30%-ного раствора сульфата цинка и 1 мл 15%-ного раствора гексациано – (II) – ферроата калия.

В результате определений получают два значения угла вращения плоскости поляризации опытных проб (П₁ иП₂) и одно значение контрольной пробы Пк. Затем вычисляют разность (rП):

rП = Пк – (П₁+П₂)/2 (15)

rП должно быть в пределах от 0,5 до2⁰ нормальной сахарной шкалы, иначе определение следует повторить, приготовляя ферментную вытяжку с большим или меньшим количеством исходной культуральной жидкости.

Зная rП, определяют активность фермента глюкоамилазы (ГлС мп, в ед./мл или ед./г):

ГлС = 0,00243 х 31 х 10⁶ х rП/(t х 2 х 180, 16 а), (16)

где 0,00243 – коэффициент пересчета величины П в глюкозу, г на 1 мл инкубационной среды, мл; 10⁶ – коэффициент пересчета в микрограммы; t - продолжительность.

Вопросы для самоконтроля знаний:

1. Охарактеризуйте технологию и расчеты осахаривания ферментными препаратами.

2. Приведите принципы методов определения активности ферментных препаратов.

Лабораторная работа № 3

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И АНАЛИЗ КАЧЕСТВА РАЗВАРЕННОЙ МАССЫ (4 ЧАСА)

Аппаратура и реактивы: лабораторная мельница, водяная баня, ячмень, ферментный препарат - бактериальную a-амилазу (амилосубтилин).

Порядок выполнения работы

Замес: Помол ячменя пропускают через сито 1 мм и в количестве 200 г заливают водой с температурой 30⁰ С в количестве 600 мл. Перемешивают. При перемешивании нагревают до 65 – 70⁰ С, добавляют бактериальную a-амилазу (амилосубтилин) из расчета 1 ед/г крахмала, т.е. 100 ед. Выдерживают при 65 – 70⁰С 20 мин.

Разваривание:

Замес нагревают до 90 – 95⁰ С при помешивании в водяной бане, выдерживают при этой температуре 20 мин. Охлаждают до 60⁰ С.

Осахаривание:

К разваренной массе добавляют солодовое молоко из расчета 10% солода по отношению к ячменю, т.е. на 200 г ячменя надо взять 20 г молотого солода.

Солод смешать с водой в отношении 1:4 и выдержать 20 мин при температуре 35⁰С.

Осахаривание осуществляют при 62⁰С в течение 1 часа.

Получают осахаренное сусло.

Вопросы для самоконтроля знаний:

1. Приведите режимы водно – спиртовой обработки зерна по мичуринской схеме с обоснованием.

2. Назовите основные стадии и нормы механико-ферментативной водно – тепловой обработки.

3. Назовите и обоснуйте преимущества механико-ферментативной схемы перед Мичуринской.

Лабораторная работа № 4