Этапы микроклонального размножения
Микроклональное размножение состоит из следующих этапов:
1. Инициация культуры invitroи ее стабилизация. Этот этап включает в себя:
*выбор маточных растений;
*поверхностную стерилизацию отобранного материала;
*вычленение экспланта и его посадка на питательную среду в пробирку;
*культивирование экспланта в климатической комнате;
2. Размножение invitro, состоящее из одного или нескольких пассажей, сопровождаемых разделением получаемых конгломератов растеньиц.
3. Укоренение in vitro или in vivo.
4. Адаптация растений к естественным условиям – сначала в теплице, а затем в поле.
1.10.1. Инициация культуры invitro.
Для подготовки введения в культуру собранные розетки промывают проточной водой, затем с помощью скальпеля отрезают листья и корни. Выделенный растительный материал складывают в стерильные чашки Петри или колбы с крышкой для дальнейшей стерилизации.
Выделение эксплантов проводится в ламинаре на стерильных листах бумаги под бинокулярным микроскопом.
В качестве эксплантов могут использоваться меристемные апексы, выделенные из дочерних розеток или верхушек плетей, при этом не наблюдается различий в поведении экспланта при дальнейшем культивировании в зависимости от происхождения экспланта. Отбор может проводиться в течение всего вегетационного периода, а при необходимости даже осенью и зимой. Однако лучшие результаты достигаются при инициации культуры весной (апрель, май). При введении в культуру эксплантов из растений, собранных осенью или зимой, наблюдается повышение уровня инфицирования эксплантов.
Наблюдается обратная зависимость между размерами экспланта и процентом оздоровленных от вирусов растений. Для получения оздоровленных растений необходимо, чтобы размер экспланта не превышал 0,4 мм, однако с уменьшением его размера понижается эффективность первого этапа культивирования, так как выживает меньшее количество меристем (Боксус, 1984). При размножении здоровыз растений размеры экспланта могут быть больше, это сокращает время стабилизации культуры invitro.
На различных этапах размножения земляники садовой invitroиспользуют различные модификации питательных сред. Состав среды зависит от культивируемого сорта.
После помещения на питательную среду меристемные клетки начинают делиться и после 2-3 недель культивирования наблюдаются зачатки побегов. Через 3-4 недели культивирования экспланты переносят на среду для размножения.
1.10.2. Этап размножения invitro.
Обычно состоит из нескольких пассажей. После того, как образуется конгломерат растеньиц, он разделяется на одиночные микророзетки и они помещаются на свежую питательную среду. При увеличении числа пересадок можно получить большее количество растений из одного экспланта, однако при этом возрастает риск появления сомаклональных мутаций, поэтому количество пассажей ограничивают 12.
На втором этапе микроразмножения в среду добавляют фитогормоны: 6-бензиладенин (ВА), ИМК и гибберелловая кислота (ГК).
1.10.3. Этап укорененияin vitro.
Земляника садовая обычно хорошо укореняется, корни могут начать формироваться на среде для размножения. Обычно после культивирования на среде для размножения в одной пробирке находятся и хорошо развитые, и отстающие в росте растеньица. Маленькие розетки (до 1 см в высоту) используют для дальнейшего микроразмножения, а регенеранты высотой более 1 см предназначаются для пересадки на среду для укоренения.
Обычно на этапе укоренения используется среда без фитогормонов. Лучшие результаты получены на среде Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией макро- и микросолей. Использование половинной концентрации солей позволяет получить растения с большим количеством корней и более развитой корневой системой, чем на среде с обычной концентрацией солей.
1.10.4. Этап адаптации exvitro.
После перенесения укорененной микророзетки из пробирки в субстрат необходимо создать условия для адаптации растений. Адаптация регенерантов земляники обычно проводится в два этапа: первый этап – в климатической комнате, второй – в теплице, где происходит и вегетативное размножение полученных маточных растений.
Укорененные растения достают из пробирок, промывают и высаживают в ящики или пластиковые горшки. В качестве субстрата можно использовать смесь торфа с песком или перлитом.
Высаженные растения накрывают полиэтиленовой пленкой для создания влажной камеры. Через 1-2 недели пленку сначала приподнимают, затем снимают. После доращивания при температуре +20 +30 градусов и 16-часовом фотопериоде розетки высотой 5-7 см и более высаживают в теплицу. При наличии хорошо оборудованной теплицы с регулируемым микроклиматом, пересаженные в субстрат регенеранты можно сразу переносить в теплицу, минуя культивирование в климатической комнате.
1.10.5. Депонирование invitro.
Для создания коллекции растений invitro, а также для удобства работы возможно длительное хранение пробирочных растений без ежемесячной пересадки. Растения сохраняются в бытовом холодильнике при +4 градусах. Пробирки упаковываются в полиэтиленовые пакеты или обматываются пленкой для уменьшения испарения.
такая схема культивирования растений-регенерантов позволяет поддерживать в культуре invitroбольшее количество сортов. Хранящиеся при низких температурах растения в любой момент могут быть использованы для обычного культивирования и размноженияinvitro.