А. Предферментационная стадия
На этой стадии осуществляется хранение и подготовка культуры продуцента (инокулята), подготовка и получение питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологических и рециркулируемых воды и воздуха.
Компоненты питательных сред подбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией того или иного источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расходуемой (выделяемой) энергии.
Поддержание и подготовка чистой культуры является очень важным моментом предферментационной стадии для получения целевых продуктов: чаще всего это биомасса микроорганизмов - продуцентов. Таковыми являются бактерии и низшие грибы, однако иногда в качестве продуцентов могут выступать клетки высших эукариот (насекомых, млекопитающих, растений). Продуцент, его физиологобиохимические характеристики и свойства определяют эффективность всего биотехнологического процесса. В отделении чистой культуры осуществляют хранение производственных штаммов и обеспечивают их реактивацию и наработку продуцента в количествах, требуемых для начала процесса.
Промышленный штамм в идеале должен удовлетворять следующим основным требованиям:
1) стабильности структурно-морфологических признаков и физиологической активности и эксплуатации в производстве;
2) повышенной скорости роста и биосинтеза целевого(-ых) продукта(ов);
3) достаточно широкому диапазону устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры, рН, перемешиванию, вязкости среды);
4) умеренной требовательности к ограниченному числу источников питания; чем более широкий набор источников углерода, азота и других элементов может использовать производственный штамм, тем легче его культивировать, и с большей выгодой.
При выращивании посевных доз инокулята применяют принцип масштабирования, т. е. проводят последовательное наращивание биомассы продуцента в колбах, бутылях, далее в серии последовательных ферментаторов. Каждый последующий этап данного процесса отличается по объему от предыдущего обычно на порядок. Полученный продуцент по стерильной посевной линии направляется далее в аппарат, в котором реализуется ферментационная стадия.
Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и совместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их состав входят нерастворимые компоненты.
В различных биотехнологических процессах применяются разные по происхождению и количествам субстраты, поэтому процесс их приготовления варьируют. Дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется индивидуально на каждом производстве в соответствии с технологическим регламентом конкретного процесса. В качестве дозирующего оборудования при этом применяются весовые и объемные устройства, используемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментаторы с помощью вакуумных насосов.
Часто применяют принцип предварительных смесей, т.е. соли предварительно растворяют и затем транспортируют по трубопроводам, дозируя их подачу по объему. В силу исключительного разнообразия биотехнологических процессов и применяемых для их реализации сред, методов и аппаратуры, рассмотрение данных элементов далее будет связано с конкретными биотехнологическими производствами.
Б. Ферментация
Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов. Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментаторе) и может быть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта.
Ферментация может происходить в строго асептических условиях или без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и твердых средах, анаэробно и аэробно.
Аэробная ферментация может протекать, в свою очередь, поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).
Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания.
При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды.
Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты - ферменты, аминокислоты, витамины, т. е. вещества, которые требуются для роста культуры клеток) и стационарной (вторичные метаболиты - антибиотики, алкалоиды, гормоны, токсины - низкомолекулярные вещества, не требующиеся для роста культуры, но необходимые для функционирования зрелой популяции, часто выполняющие защитную функцию) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования.
В результате этого создаются условия для максимального производства того или иного целевого продукта. Непрерывная ферментация биообъектов осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны, т. е. в стационарной фазе.
Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения.
Первый пример - так называемая тубулярная культура: процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательная среда и инокулят, а с другой - с той же скоростью вытекает культуральная жидкость и целевые продукты. Данная система проточной ферментации является гетерогенной и реализуется, как правило, без перемешивания. При непрерывной ферментации в ферментаторах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии.
Обеспечение процесса ферментации с точки зрения инженерной реализации сводится к дозированному поступлению в ферментатор потоков (инокулята, воздуха или газовых смесей, питательных биогенных элементов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также к измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта.
В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов.