Класифікація хроматографічних методів аналізу
Існує багато варіантів здійснення хроматографічного аналізу. В основу класифікацій хроматографічних методів покладені принципи, що враховують наступні різні особливості процесу розділення:
• відмінності в агрегатному стані фаз хроматографічної системи, що розділюється;
• відмінності в характері взаємодій речовин, що розділюються, з нерухомою фазою;
• відмінності в способах практичної реалізації процесу хроматографічного розділення.
Наведемо основні варіанти класифікації відомих хроматографічних методів.
І. За агрегатним станом нерухомої та рухомої фаз.Для досягнення оптимального розподілу компонентів сумішей необхідно обрати оптимальну комбінацію стаціонарної та рухомої фази). Сорбент (нерухома фаза) може бути твердою речовиною або рідиною, що сорбована на твердому носії; рухома фаза може бути рідиною або газом; сорбати можуть перебувати у рідкому, газуватому або пароподібному стані (таблиця 1).
Газорідинна хроматографія на сьогодні ще не реалізована, на практиці використовують лише газо-рідинно-твердофазний метод, коли стаціонарною фазою є твердий носій з нанесеною на його поверхню рідиною.
ІІ. За природою сил міжфазової взаємодії сорбенту та сорбованих речовин (сорбатів) – за механізмом розділення,хроматографію поділяють на два основні види – молекулярну та іонообмінну, де реалізується розподіл відповідно молекул або іонів між фазами. До молекулярної відносять такі види хроматографії: адсорбційну, розподільчу, ексклюзійну (ситову, гель-проникну, гель-фільтраційну), афінну (біоспецифічну) хроматографію. До іонної – іонообмінну, іон-парну, лігандообмінну, осадову.
При адсорбційнійадсорбція речовин відбувається на полярному сорбенті з неполярного елюенту завдяки донорно-акцепторній взаємодії чи утворенню водневих зв’язків (нормально-фазна) або на поверхні гідрофобізуючого сорбенту з полярного елюенту за допомогою дисперсійної (гідрофобної) взаємодії розділюваних молекул із поверхнею (збагачено-фазна).
Розділення в розподільчій хроматографії відбувається за рахунок розподілу хімічних сполук між двома фазами – нерухомою та мобільною. Залежно від полярності фаз можливими є нормально-фазний та збагачено-фазний варіанти.
У основі іонообмінної – хімічна реакція іонного обміну, різна здатність іонів до реакцій іонного обміну з фіксованими іонами сорбенту, які утворюються у результаті дисоціації іоногенних груп останнього.
Іон-парну можна розглядати як комбінацію адсорбційної та іонообмінної; як нерухому фазу використовують гідрофобізуючий адсорбент, як мобільну – водно-органічний елюент з додаванням поверхнево-активних іоногенних сполук (іон-парних реагентів). Розділення основане на утриманні іон-парного реагенту на гідрофобній поверхні сорбенту з утворенням іоніту, який розділяє іонні сполуки.
Лігандообмінна базується на різній здатності сполук утворювати комплекси з катіонами перехідних металів (Cu(II), Ni(II), Zn(II), Cd(II), Co(II), тощо) та фіксованими лігандами нерухомої фази.
Афінна передбачає утворення міцного зв’язку зі специфічними групами (лігандами, афінатами) нерухомої фази на основі біологічних властивостей останніх. Так при розділенні ферментів лігандами служать їх субстрати, інгібітори чи коферменти, токсинів – рецептори, білків – антитіла.
Розподілу в ексклюзійній(ситовій, гель-проникній, гель-фільтраційній) РХ відбувається за рахунок різниці у розмірах молекул. Метод ґрунтується на розділенні молекул суміші за розміром з урахуванням їх різної здатності проникати у пори носія. При цьому першими з колонки виходять більші за розміром молекули (більшої молекулярної маси), які здатні проникати у мінімальне число пор носія. Останніми елююють речовини з малими розмірами молекул, які вільно проникають у пори сорбенту.
Осадовабазується на різній розчинності осадів, що утворюються при взаємодії компонентів досліджуваної суміші з реагентом-осаджувачем. Перевагами цього методу є те, що розташовані вздовж сорбенту зони мають чіткі межі.
На практиці часто застосовується декілька механізмів розділення одночасно (адсорбційно-розподільчий, адсорбційно-ексклюзійний, тощо).
ІІІ. За апаратурним оформленням або способом проведення хроматографічного процесу:колонкова (в колонці або капілярі) і площинна (на папері або в тонкому шарі сорбенту) хроматографія.
1. Колонкова – нерухомою фазою, наприклад, гранулами діаметром 0,1-0,5 мм заповнюють трубку діаметром 2-6 мм і довжиною декілька метрів (набивна колонка) (рис. 2). Якщо нерухома фаза – рідина, вона наноситься на поверхню і в пори гранул інертного носія. Варіантом колонкової хроматографії є капілярна, коли рідка фаза наноситься на внутрішню стінку капіляра діаметром 0,1-0,5 мм і довжиною до 100 і більше метрів (рис. 3).
2. Площинна – використовується при рідкій нерухомій фазі:
а) тонкошарова – скляна або алюмінієва пластина, покрита тонким шаром носія, утримує нерухому фазу – розчинник;
б) паперова – нерухома фаза – спеціальний хроматографічний папір (типу фільтрувального), просочений відповідними реактивами.
У площинній хроматографії рух рухомої рідкої фази здійснюється завдяки капілярним силам.
IV. За методикою проведення аналізу:
1. Проявна (елюентна) хроматографія – в безперервний потік рухомої фази Е, яка практично не сорбується (елюента), вноситься порція об'єкту аналізу – суміш речовин A і B. Далі суміш промивають елюентом, який зазвичай підбирається так, щоб він не давав аналітичного сигналу. Елюент захоплює частину компонентів об'єкту аналізу, яка знаходиться в рівновазі між ним і нерухомою фазою, і просуває їх вздовж нерухомої фази з різними для кожного компонента швидкостями. При достатній довжині колонки відбудеться повне розділення зон, причому компонент А, який менше сорбується, займе нижнє положення в колонці. Зона, яка містить компонент В з більшою сорбційною здатністю, буде розміщений у верхній частині. Між зонами сорбент буде заповнений чистим розчинником, тому отримується повне розділення компонентів (рис. 1, середній). Зміну концентрації речовин, що розділяються, по виходу з колонки зображують у вигляді кривої – хроматограми (рис.2). Зазвичай по осі абсцис відкладають об’єм газу-носія V (елюента), що проходить через колонку, а по осі ординат – зміну концентрації компонента, що хроматографується, після виходу його з колонки. Такий спосіб розділення використовують переважно в газовій хроматографії під час аналізу органічних речовин, і він дозволяє практично повністю розділити суміш на складові компоненти. Він є найбільш уживаним у високоефективній хроматографії і єдиним способом кількісного аналізу. Недолік методу полягає в тому, що внаслідок використання порівняно великої кількості елюента і відповідно значного розведення аналізовано суміші елюентом, концентрація компонентів після розділення стає у багато разів меншою, ніж вхідна (метод не для концентрування).
2. Фронтальна – при роботі за фронтальним методом крізь колонку безперервно пропускають об'єкт аналізу, який сам є рухомою фазою, і вимірюють концентрацію кожного компонента на виході з колонки. Сорбент насичується компонентами суміші з кращою здатністю до сорбції, а компонент з гіршою здатністю до сорбції рухається попереду інших вздовж шару сорбента і покидає колонку в чистому вигляді. Отже, крізь колонку спочатку проходить речовина, яка сорбується найгірше, а потім її суміш з речовиною, що сорбується краще, і т.д. Цей метод дозволяє виділити з суміші тільки одну, найменш здатну до сорбції речовину, тому для розділення речовин він малопридатний. Проте метод є ефективним для виділення чистої речовини із технічного продукта за умови її найменшої здатності до сорбції або накопичення окремих речовин із дуже розбавлених розчинів за допомогою спеціальних сорбентів. Фронтальний аналіз застосовують, зокрема, для очищення води йонообмінними адсорбентами та очищення повітря активованим вугіллям в протигазах.
3. Витіснювальна– в нерухому фазу вноситься порція об'єкту аналізу – суміш компонентів А і В, розчинених в елюенті Е. Ця порція витискається через шар нерухомої фази потоком речовини-витіснювача D, який сорбується сильніше, ніж компоненти об'єкту аналізу. Компоненти суміші рухаються попереду фронта витіснювача до виходу з колонки з однаковою швидкістю, розділившись на зони, що дотикаються між собою, у відповідності зі здатністю до сорбції. Використання цього методу ускладнюється важкістю вибору необхідної концентрації речовини-витіснювача, взаємною дифузією на межі зон, яка перешкоджає отриманню на виході з колонки достатньо чистих компонентів, і тривалістю процесу розділення. При вдалому виборі витіснювача з колонки можна витіснити тільки одну речовину, яка сорбується найгірше. Цей метод використовується в основному при визначенні мікродомішок.
Фронтальний та витіснювальний варіанти хроматографії потребують регенерації колонки перед наступним дослідом.
V. Залежно від мети проведення хроматографічного процесу розрізняють аналітичнуі препаративну хроматографію. Аналітичну хроматографію використовують для визначення якісного та кількісного складу зразка. Зазвичай для цього відбирають малу кількість зразка (до 10 мг). Часто для отримання інформації не є обов'язковим повне розділення компонентів зразка, що визначається. Можна використовувати такі форми детектування, за яких відбувається руйнування досліджуваних речовин. Після розділення компоненти суміші не потрібні, тому їх викидають або знищують. Відповідно до малих кількостей зразка в аналітичній хроматографії використовують колонки малих розмірів (малого діаметра). Препаративна хроматографія – це процес виділення речовин із суміші у чистому вигляді в лабораторних умовах або у виробничих процесах з метою їх подальшого використання. Працюють з великою кількістю зразка (понад 10 мг, може бути більше 1 кг). Оскільки речовини розділяють для подальшого використання, не можна застосовувати деструктивні способи детектування. Колонки більші, ніж в аналітичній хроматографії.
VI. За ефективністю хроматографічного розділення, розрізняють класичну та високоефективну (під тиском) хроматографію. У випадку класичної хроматографії, тобто подібного до запропонованого М.С.Цвєтом варіанта, пробу вводять у колонку вручну, далі пропускають рухому фазу, яка проходить крізь сорбент під дією сили тяжіння та капілярних сил. На виході з колонки елюат збирають окремими порціями певного об'єму й аналізують у так званому режимі off-line (фракційний метод аналізу). У разі високоефективної хроматографії колонку малого внутрішнього діаметру заповнюють дрібнодисперсним сорбентом щільно, так що рухома фаза не може рухатись вздовж колонки за атмосферного тиску. Тому для протікання як проби, так і рухомої фази потрібно прикласти тиск, тобто підключити насос. Оскільки під тиском рухома фаза просувається досить швидко, то проводити аналіз у режимі off-line недоцільно. На виході з колонки приєднують детектор, в якому безперервно вимірюється певний параметр елюату, що прямо пропорційний концентрації досліджуваного компонента. Це так званий режим in-line.
На сучасному етапі розвитку хроматографічних методів класичну хроматографію більше використовують із препаративною метою. Високоефективну хроматографію застосовують для якісного і кількісного аналізу.