Протокол исследования колонии. 5.Прозрачность колоний_________________________________

1.Размер колонии_______________________________________

2.Форма колонии_______________________________________

3. Поверхность колонии_________________________________

4. Края колонии________________________________________

5.Прозрачность колоний_________________________________

6.Пигмент_____________________________________________

7.Консистенция________________________________________

8.Форма бактерий______________________________________

9. Взаиморасположение бактерий_________________________

10.Латинское морфологическое название бактерий__________

 

3. Для бактериологического исследования используются свежие фекалии, со­бираемые в стерильную посуду (пробирки или пенициллиновые фла­коны) без консерванта. Материал должен быть исследован в течение 2 часов с момента дефекации.

Существует несколько методов исследования микрофлоры ки­шечника, большинство из которых сводится к количественному ис­следованию предварительно взвешенной навески фекалий.

Взвешивание проводится на стерильной пергаментной бумаге (навеска должна быть в пределах 0,5-1,0 г.), которая затем помещается в фарфоровую ступ­ку и заливается таким количеством фосфатно-тиогликолевого буфе­ра, чтобы получилось соотношение 1:10. Содержимое ступки тщательно растирается и отстаивается в течение 10 мин для оседания плотных частиц. Затем 0,5 мл содержимого из ступки переносится в пробирку с 4,5 мл фосфатно-тиогликолевого буфера и тщательно перемешива­ется. В дальнейшем материал последовательно раститровывается по 0,5 мл в 6-ти пробирках (получаются десятикратные разведе­ния). Из 6-й пробирки материал в количестве 0,1 мл переносится в пробирку с 9,9 мл буфера, а из неё 0,1 - в следующую пробирку с аналогичным количеством буфера. Таким образом, в ступке содержится разведение материала 10-1, а в последней пробирке – 10-11. Посев целесообразно начинать с разведения 10-11, исполь­зуя концевую пипетку на 1,0 мл.

Для выделения бифидобактерий по 0,1 и 1,0 мл из разведе­ний 10-11, 10-9 и 10-7 засевают в пробирки с регенерированной средой Блаурокка; при этом получается 6 пробирок с разведения­ми от 10-7 до 10-12.

Для выделения бактероидов по 0,1 мл из этих же разведений материала засевают на КАБ (кровяной агар бактероидов) с неомицином и культивируют по модифицированному методу Фортнера: площадь посева закрывают преципитационными (малого диаметра) чашками, создавая стро­го анаэробные условия, необходимые для культивирования бакте­роидов.

По 0,1 мл разведений 10-7, 10-6 и 10-5 засевают на молочно-растительную среду /МРС/ - для выделения лактобацилл. Из разведений 10-6 и 10-5 делают посев по 0,1 мл на среду Эндо - для изоляции энтеробактерий; 0,1 мл из разведения 10-6 засе­вают на кровяной агар - для выявления гемолитической активности аэробной микрофлоры.

Для выявления энтерококков используют среду Калины, засе­вая по 0,1 мл из разведений 10-6 и 10-5.

По 0,1 мл из разведения 10-4 засевают на чашечную среду Симмонса, позволяющую изолировать наиболее часто встречаемые УПЭ (представителя рода Цитробактер и трибы Клебсиелла) и на желточно-солевой агар - для выделения стафиллококков.

0,1 мл из разведения 10-3 засевают на среду Сабуро с полимиксином - для выделения дрожжей и дрожжеподобных грибов. Для выделения клостридий по 0,1 мл из разведений 10-3 и 10-4 засевают на среду Вильсон-Блера.

Все посевы инкубируют в термостате при 37 °С.

На второй день исследования:

1. Производят учёт роста на среде Эндо. Подсчитывают общее
число, выросших колоний кишечных палочек, обращая внимание на их характер (цвет, наличие металлического блеска, диссоциацию, формы с пониженной ферментативной активностью). При обнаруже­нии лактозоотрицательных колоний анализ ведут как при выявле­нии патогенных представителей семейства энтеробактерий.

2. Кровяной, желточно-солевой агар и среду Сабуро извлекают из термостата и оставляют для дальнейшей инкубации при комнатной температуре, а желточно-солевой агар - при действии рассеянного света - для лучшего выявления пигментообразования.

На третий день исследования:

1. Производят учёт роста УПЭ на среде Симмонса. Помимо УПЭ (представителей родов Цитробактер, Энтеробактер, Клебсиелла, Гафния, наиболее часто выделяемых из фекалий, а также Про­виденсия, изолируемых из этого материала реже), дающих белые или окрашенные в цвет среды мелкие и средней величины слизистые или сухие колонии, часто в R-форме, изменяющие (в случае ути­лизации цитрата натрия) цвет среды до синего или не изменяю­щие его, вырастают кишечные палочки, в том числе и с пониженной ферментативной активностью, в виде очень мелких, прозрачных, зеленовато-белых колоний. Подсчитывают общее число колоний УПЭ, выросших на среде Симмонса, - делая перерасчёт на 1 г. В случае роста на чашке колоний УПЭ нескольких типов ведут подсчёт каж­дого из них и соответствующий пересчёт на 1 г фекалий.

Для идентификации УПЭ производят посев части изучаемой колонии на скошенный МПА, а другой части - на среду Кларка.

2. Учитывают количество колоний стафилококка, подтверж­дённого изучением морфологии в окрашенном по Граму мазке, на желточно-солевом агаре, делают пересчёт на 1 г, определяют пигментообразование и образование лецитиназы (лецитовителлазы), производят отсев колонии для выделения чистой культуры и даль­нейшего определения вида стафилококка.

3. Производят подсчёт числа колоний энтерококка на среде Калины (с пересчётом на 1 г), определяют наличие или отсутствие протеолитической активности.

4. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие ге­молиза, в положительном случае определяют морфологию микроор­ганизма; подсчитывают % гемолитических форм к общему количест­ву выросших на этой среде колоний.

5. Отмечают наличие чёрных колоний на среде Вильсон-Блера, подсчитывают их общее количество (с переводом на 1 г), подт­верждают принадлежность выросших микроорганизмов к клостридиям изучением морфологии в окрашенном по Граму мазке. Нередко на этой среде вырастают, представители рода Протеус и Цитробактер, давая колонии, схожие с колониями клостридий.

6. Регистрируют рост на среде Сабуро с полимиксином, где вырастают дрожжи и дрожжеподобные грибы, давая белые средней величины и крупные колонии. Морфологию микроорганизмов подт­верждают микроскопией окрашенных по Граму препаратов. Опреде­ляют общее количество выросших колоний, делают пересчёт на 1 г, а для дифференциации дрожжей от дрожжеподобных грибов рода Кандида, делают посев на картофельный или крахмальный агар (для определения филаментации, характерной для грибов рода Кандида и отсутствующей у дрожжей).

На четвёртый день исследования:

I. Учитывают рост бифидобактерий на среде Блаурокка. Для этого из каждой пробирки с ростом готовят мазки, окраши­вают по Граму и микроскопируют. При микроскопии препаратов от­мечается характерная для бифидобактерий морфология и расположение. Учитывают предельное разведение материала, в котором ещё регистрируется рост бифидобактерий, подтверждённый нахож­дением этих микроорганизмов в окрашенных по Граму препаратах. При этом, не допуская большую ошибку, можно перевести предель­ное разведение материала на количество бифидобактерий в 1 г фекалий. Допустим, предельным разведением материала, в котором зарегистрирован рост бифидобактерий, подтверждённый изуче­нием морфологии в мазке, было 10-10. С большой долей вероятнос­ти можно считать, что количество бифидобактерий в 1 г фекалий соответствует 1010 (этот пересчёт необходим для дальнейше­го определения соотношения бифидобактерий и других микроорга­низмов).

2. Регистрируют рост лактобацилл на МРС, подсчитывают об­щее число колоний этих микроорганизмов, приводят к 1 г. Лактобациллы на МРС растут в виде мелких беловато-серых с ров­ными краями или более крупных желтовато-серых с изведенными краями колоний, дифференцировать которые от колоний других микроорганизмов не предоставляет особого труда. Лактобациллы до­вольно хорошо растут на среде Сабуро с полимиксином.

3. Производят учёт бактероидов на КАБах. На этой среде указанные микроорганизмы растут в виде мелких беловато-серых колоний; в мазке - это грамоотрицательные мелкие палочки, рас­положенные без особого порядка. Делают пересчёт для определе­ния количества бактероидов в 1 г фекалий. Для дифференциации бактероидов от лактобацилл, спорообразующих бактерий и др. микроорганизмов производят посев части колонии на КАБ с после­дующим культивированием в аэробных условиях, а также окраску, на выявление спор.

4. Повторно учитывают рост грибов рода Кандида на среде Сабуро с полимиксином (при отсутствии роста на этой среде че­рез 24-48 часов); при наличии роста, производят изучение как в п.6 третьего дня исследования.

5. Для идентификации УПЭ производят посев чистой культу­ры со скошенного МПА на среды с аминокислотами (лизином, аргинином, орнитином).

На пятый день исследования:

1. Производят учёт филаментации (если предварительно бы­ли подозрительные колонии на среде Сабуро).

2. Учитывают тесты, дифференцирующие бактероиды от лакто­бацилл и аэробов (по отсутствию роста на МРС и на КАБах в аэ­робных условиях).

3. Для идентификации УПЭ производят учёт изменений со сред с аминокислотами, а также результатов реакции Фогес-Проскауэра и с метиловым красным, что в ряде случаев даст возможность ус­тановить род и вид; в том случае, когда идентификацию по ука­занным тестам провести не удаётся, проводят посев на дополни­тельные углеводы.

4. Выдача ответа.

В ответе следует указать количество анаэробов (бифидобак­терий, бактероидов, лактобацилл), а также количество аэробных микроорганизмов различных родов, изолированных из 1г фекалий.

В заключении следует указать на отсутствие или наличие дисбактериоза кишечника и степень его выраженности.

Основой для заключения должно быть соотношение количества бифидобактерий (как основных представителей анаэробной группы бактерий, выполняющих наиболее важную для организма физиологи­ческую функцию) и аэробов.

При установлении пограничных состояний между нормой и па­тологией очень важным показателем является соотношение между бифидобактериями и E.coli.

Для его установления количество бифидобактерий, определён­ных в конкретном образце, подтверждённых изучением морфологии в окрашенных по Граму препаратах, принимают за 100 %, а количество E. coli за Х. Составляют пропорцию и высчитывают значение X.

Например, количество бифидобактерий в I г = 1010, а коли­чество E. coli = 700 млн.

Составляем пропорцию:

1010 ------ 100 %

700 млн ----- X


X = 7 %

 

Данный показатель превышает норму (5 %) и свидетельствует о начальных сдвигах в микрофлоре (нарушение соотношения между бифидобактериями и E. coli), что может быть определено как дисбактериоз I степени. Однако такие расчёты следует проводить не во всех случаях, а только тогда, когда имеются затруднения в диф­ференциации дисбактериоза I степени и эубиоза.

Приложение к ЗАНЯТИЮ 11