Оптимізація способу визначення карбоксигемоглобіну в крові людей

Львівський університет

Найважливішим механізмом токсичної дії СО є лігандування з гемопротеїдами, і, в першу чергу, з гемоглобіном. Взаємодія оксиду вуглецю з гемоглобіном крові призводить до утворення карбоксигемоглобіну (СО-Нв), наслідком цього є зниження киснезв`язуючої здатності крові, причиною високої конкурентно здатності оксиду вуглецю відносно кисню є його висока спорідненість до дезоксигемоглобіну, яка перевищує в 250 – 300 разів спорідненість до даного дихального білка кисню [3, 5, 6]. Таким чином при підвищеній концентрації оксиду вуглецю в середовищі утворюється патологічний комплекс СО-Нв, що веде до немічного типу кисневої недостатності. Надходження кисню до клітин тканин при цьому значно знижується.

В останнє десятиліття багатьма дослідженнями встановлено, що одним із джерел оксиду вуглецю є повітря, яке людина видихає. Цей, ендогенного походження оксид вуглецю, утворюється при метаболізмі гемвмісних білків. У випадку перебування людини в герметизованих приміщеннях накопичується оксид вуглецю, який стає причиною аутоинтоксикації.[5].

Діагностика, лікування і профілактика отруєнь чадним газом потребують розробки експресивних і надійних методів визначення СО-Нв у крові людини. Одним із перспективних методів є метод спектрофотометричного аналізу комплексу СО-Нв [7]. Цей методичний підхід найбільш підходить для широкого використання, особливо в двохвилевому варіанті аналізу бінарних сумішей гемоглобінів. В цих випадках найчастіше використовують дитионітний метод аналізу карб оксигемоглобіну в різних модифікаціях [3]. Теоретично доведено, що для аналізу двокомпонентних систем достатньо вибрати дві довжини хвилі, одну із яких зручно брати в ізобестичній точці [8].

В наших дослідженнях в якості вихідного матеріалу визначення карб оксигемоглобіну бів обраний дитіонітний метод з використанням двох довжин хвиль – 538 і 550 нм [4].

Ціллю даної роботи було теоретичне обґрунтування і методичне здійснення оптимізації способу визначення карбоксигемоглобіну в цільній крові людей. В результаті вибрані оптимальні параметри процесу гемолізу еритроцитів крові і реакції відновлення гемоглобіну, які дозволяють підвищити простоту, експресивність і точність виконання аналізу на автоматичному фотометрі, створеному для цієї цілі.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Дослідження проводили на очищення гемоглобіну, відмитих від плазми еритроцитах і цільної крові. Гемоглобін із еритроцитів крові людини отримували по методу Драбкина [9]. Концентрацію гемоглобіну визначали в ціанометформі [7].

, де

Д – оптична густина розчину гемоглобіну при 540 нм; 100 – розведення, 10,99 - мілімолярний коефіцієнт екстинції (в розрахунку на 1 гем), ціанметгемоглобіну при 540 нм [7]; 4 - коефіцієнт перерахунку від 1 гема на тетраметр.

Спектрофотометричні виміри проводили на приборах СФ-26 і "Спекорд" (ГДР).

Оксигемоглобін; до 0,1 мл 1 мМ розчину гемоглобіну, додатково оксигенованого чистим О₂ і перевіреного на відсутність метформии по Родки і О`Нилу [10], додавали 4,9 мл відповідного буферу і проводили спектрофотометрування протии буфера.

Отриманий розчин гемоглобіну слугував також вихідним для приготування дезокси- і карбоксиформ.

Дезоксигемоглобін отримували додаванням до 5 мл розчину НвО₂ 3-5 мг сухого дитіоніту натрія. Через 2-3 хвилини проводили спектрофотометри чні виміри.

Карбоксигемоглобін готували пропускаючи СО через розчин оксигемоглобіну протягом 15-20 хв.

Калібрувальні досліди. Для визначення кількісного вмісту карбоксигемоглобіну в суміші з дезоксигемоглобіном будували калібрувальні графіки. В якості вихідних розчинів використовували 10 мкМ-ні оксигемоглобін і карбоксигемоглобін в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,3. Модельні суміші з вмістом СО-Нв від 10 до 100% отримували з допомогою двох послідовно розміщених по ходу променя 1 см-кювет, помістивши в кожну відповідну форму гемоглобіну при концентраціях, вказаних в табл. 1.

В проби з 5 мл оксигемоглобіну безпосередньо перед спектрофотометруванням вносили 8 мг відновлюючої суміші А (див. нижче) для отримання дезоксиформи (оптичну густину «сумішей» вимірювали при 538 і 550 нм через 2-3 хв після додавання відновлювача проти води, яка також внесена у дві кювети.

Таблиця 1

Дані калібрувальних дослідів визначення СО-Нв в «суміші» з нВ (спектрофотометр СФ-26)

№ п/п	% СО-Нв	СО-Нв (с=10 мкМ) мл	3 мМ фосфатний буфер, рН 7,36 мл	Нв (с=10 мкМ) мл	3 мМ фосфатний буфер, рН 7,36 мл	% Нв	Д₅₃₈	Д₅₅₀	Д₅₃₈/Д₅₅₀
		4,5	0,5	0,5	4,5		0,536	0,461	1,16
		4,0	1,0	1,0	4,0		0,520	0,462	1,12
		3,5	1,5	1,5	3,5		0,502	0,462	1,09
		3,0	2,0	2,0	3,0		0,497	0,481	1,01
		2,5	2,5	2,5	2,5		0,476	0,485	0,98
		2,0	3,0	3,0	2,0		0,472	0,485	0,96
		1,5	3,5	3,5	1,5		0,450	0,485	0,92
		1,0	4,0	4,0	1,0		0,436	0,502	0,87
		0,5	4,5	4,5	0,5		0,425	0,508	0,84
			5,0	5,0			0,415	0,517	0,80

Калібрувальні досліди повторювали три рази. По середніх значеннях оптичних густин визначали відношення Д₅₃₈/Д₅₅₀ і будували калібрувальний графік залежності цього параметра від відсоткового вмісту СО-Нв (табл. 1, рис. 1). На основі параметрів отриманої калібрувальної прямої виведена аналітична формула для розрахунку відсоткового вмісту СО-Нв в суміші.

(1)

Кінетику гемолізу еритроцитів крові розчинами різного складу досліджували наступним чином. До 3 мл розчину, який досліджували на гемолітичну активність (в кюветі) додавали 20 мкл еритромаси. Суміш швидко перемішували і через 30 с знімали залежність густини розчину при 630 нм від часу, на СФ-26, якмй оснащений самописцем Н-39. Контролем слугувала вода.

Визначення вмісту карбоксигемоглобіну в цільній крові людей. Для аналізів використовували периферичну кров (20-30 мкл), взяту із пальця за допомогою скляного капіляра попередньо промитого розчином гепарину (50000 од/мл). для відновлення гемоглобіну використовували сухі суміші дитіоніту натрію з компонентами а, К-фосфатного або боратного буферу. Розрахунок кількості компонентів проводився з урахуванням кінцевої концентрації буферу 3-5мм і рН 7,36 (для фосфатного) і рН 9,18 (для боратного) і вмісту дитіоніту на 1 пробу об`ємом 3 мл - 4 мг.

Склад сумішей

Суміш А: а₂НРО₄ ▪ 12Н₂О – 0,2602 г; КН₂РО₄ – 0,0236 г; а₂ ₂О₄ – 0,4000 г.

Суміш Б: а₂В₄О₇ ▪ 10Н₂О – 0,3432 г; а₂ ₂О₄ – 0,4000 г.

Для дозування кількості внесеної відновлюючої суміші використовували ложечку – дозатор, яка відбирає -8 ± 1 мг суміші А і 11 ± 1,5 мг – для суміші Б.

У 1 см кювету з 3 мл Н₂О вносили 20-30 мкл гепаринізованої крові, закривали кришкою, вміст перемішували. Через 1-2 хв до розчину додавали відновлюючу суміш, перемішували. Оптичну густину розчину вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при 536 і 550 нм. Розрахунок СО-Нв проводили за формулою (1).

У серійних визначеннях використовували набір пробірок, які містили по 3 мл води, в які вносили по 20-30 мкл гепаринізованої свіжої крові. Суміш перемішували. Після закінчення серій взяття крові у кількох людей в кожну пробу безпосередньо перед спектрофотометруванням вносили відновну суміш і через 1 хв проводили вимірювання.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У зв'язку з тим, що в якості початкового способу визначення карбоксигемоглобіну нами застосований дитіонітний метод [4], було проведено дослідження оптимальних параметрів реакції відновлення HвO₂ до Нв. На підставі порівняльних спектрофотометричних досліджень встановлено, що повне переведення НвО₂ в Нв і сталість спектральних характеристик останнього спостерігається в широкому діапазоні молярності (3,3 - 100 мМ) і рН (6,0 - 9,18) двох досліджуваних буферів - фосфатного і боратного Для повного відновлення 5 мл 20 мкМ гемоглобіну потрібно З-5 мг дитіоніту натрію. Карбиксигемоглобін в діапазоні вказаних параметрів системи також зберігає сталість своїх спектральних властивостей.

Одним з важливих умов виконання аналізу лігандних форм гемоглобіну в цільній крові є забезпечення повного гемолізу еритроцитів. У зв'язку з цим була досліджена гемолізуюча здатність води, деяких буферів, а також детергентів – сапонінів і тритон Х-100. На рис. 2 представлена кінетика гемолізу еритроцитів людини водою, 3,3 мМ фосфатним буфером і різними концентраціями сапоніну (від 0,01 до 0,16 мг/мл). Виявилося, що вода гемолізує еритроцити приблизно за 4-5 хв, 3 мМ фосфатний буфер, рН 7,36 руйнує еритроцити приблизно через 1 хв, причому оптична густина отриманого гемолізату при 630 нм істотно нижча, ніж для водного гемолізату, що свідчить про кращу розчинності строми в буфері, ніж просто в Н₂О. Гемолізуюча здатність сапоніну з підвищенням концентрації збільшується від 5 хв при С = 0,01 мг/мл до приблизно 0,5 хв при С = 0,16 мг/мл. Однак застосування сапоніну з концентрацією більше 0,06 мг/мл призводить до збільшення поглинання при 630 нм, що пов'язано, мабуть, з помітним помутнінням розчину. Причина цього явища не зрозуміла. Можливо, при більших концентраціях сапоніну спостерігається денатурація білка, як це відмічено для впливу додецилсульфату натрію на гемоглобін [1].

На рис.3 показано кінетику гемолізу еритроцитів фосфатним і боратним буферами (рН 7,36 і 9,18 відповідно) з різною молярністю - 3,3-100 мМ. Фосфатний буфер стабілізує еритроцити починаючи з концентрації 0,1 М, а боратний - з 2 мМ. Оптимальними концентраціями для забезпечення гемолізу є 3-10 мМ для фосфатного і 3-5 мМ для боратного буферу, причому швидкість гемолізу в таких умовах вища, ніж в H₂O. Крім того остаточна оптична густина гемолізату в таких буферах нижча, ніж в H₂О, що пов'язано, судячи з усього, з кращою строморозчиняючою здатністю буферів, ніж води.

На рис.4 представлені результати вивчення гемолізуючої здатності водних розчинів тритон Х-100 при різних концентраціях цього детергенту. Показано, що детергент гемолізує еритроцити дуже швидко (1 хв) в діапазоні концентрацій: 0,1-1,0%, забезпечуючи при цьому велику стромо розчинну здатність, ніж вода. Встановлено також, що присутність тритон Х-100 у встановлених концентраціях не впливає на спектральні характеристики дезоксигемоглобіну. Таким чином, з точки зору забезпечення повного і швидкого гемолізу еритроцитів і кращого розчинення компонентів строми найбільш оптимальними виявились фосфатний і боратний буфери (рН 7,36і і 9,18) з молярністю 3-5 мМ, а також тритон Х-100 при концентрації 0,1-1,0%. Для подальших аналізів СО-Нв в цільній крові нами використані відновлювальні суміші на основі двох буферів – фосфатного і боратного, які дають практично однакові результати (див. таблицю 2). Були проведені одиничні і серійні визначення карбоксигемоглобіну в цільній крові людей (див. розділ "матеріали і методи»).

Ці два підходи дають аналогічні результати. Серійний варіант проведення аналізів має ту перевагу, що одночасно можна взяти кров на дослідження у багатьох людей і створюються оптимальні умови гемолізу еритроцитів.

Таблиця 2

Вміст карбоксигемоглобіну в цільній крові людей

№ п/п	суб	Боратний буфер	Фосфатний буфер	Загальне середнє % СО-Нв
	% СО-Нв		% СО-Нв
М+	М+
	А		1,03 ± 0,55			1,30 ± 0,55
	Б		3,38 ± 0,82		2,45 ± 0,79	2,91 ± 0,47
	В		2,98 ± 0			2,98 ± 0
	Г		6,27 ± 0,90		5,35 ± 2,58	5,81 ± 0,46
	Д		4,02 ± 0,35		3,13 ± 0,38	3,57 ± 0,44
	Е		3,75 ± 0,67		3,91 ± 0,09	3,83 ± 0,08
	Ж		5,91 ± 0,65		7,23 ± 0,71	6,57 ± 0,66
	З		2,69 ± 1,37			2,69 ± 1,37
	И		1,03 ± 0,49		0,80 ± 0	0,91 ± 0,11

Точність аналізу карбоксигемоглобіну залежить у великій мірі і від похибки шкали використовуваного спектрофотометра (СФ-26). Так, похибки при вимірах оптичної густини на 0,010-0,005 одиниць призводять до похибки у визначенні вмісту СО-Нв - на 3%.

Слід зазначити, що дуже важливим елементом, що забезпечує точність результатів, є недопущення утворення фібрину, яке веде до появи каламуті в розчині. Для цієї мети капіляр для забору крові повинен бути попередньо промитий гепарином. Крім того, не рекомендується брати більше трьох проб крові з одного проколу пальця оскільки в протилежному випадку ймовірність утворення фібрину підвищується. Для більшої надійності визначення рекомендується проводити два-три паралельних аналізи. Зазначені складності не зустрічаються при аналізі СО-Нв в гепаринізованій крові, взятої з вени.

З метою практичного застосування оптимізованої нами методики було проведено аналіз карбоксигемоглобіну в цільній крові здорових людей (табл. 2). Позначилося, що вміст СО-Нв в крові коливається в межах 0,9-6,6%. Із літератури відомо, що у здорових некурящих людей карбоксигемоглобін виявляється в кількостях від 0,25 до 2,1% загального гемоглобіну. У курящих ці величини можуть зростати до 6,6% [3]. Забруднення повітря в міській місцевості підвищує вміст СО-Нв в крові до 2-4%, причому у курців до 2-4%, а в деяких випадках і до 16% [8].

Таким чином, отримані нами результати з урахуванням помилки визначення знаходяться у відповідності з літературними даними. Відповідно, модифікація відомого способу визначення С0-Нв [4], який полягає у спрощенні процедури аналізу – застосування в якості реактивів тільки води і сухого реагенту, який поєднує функції буферної системи і відновника і не перешкоджає гемолізу еритроцитів, дозволяє добитися достатньої точності і відтворюваності результатів аналізу при кращій його пристосованості для виконання на автоматичному фотометрі.

ЛІТЕРАТУРА

1. Артюхов В.Г., Шмельов В.П. Український біохімічний журнал. 1977 т.49, »2, с.12-15

2. Доіс видання. Кількісні проблеми біохімії. М:. Світ, 1983.

3. Кушаковський М.С. Клінічні форми пошкодження гемоглобіну .- Л. Медицина 1968 року.

4. Методичні вказівки про кількісний визначенні карбоксігемо глобіну і карбоксимиоглобина. М:. МОЗ СРСР, 1974.

5. Сксенгендлер Г.І. Отрути і протівоядія.Л. Наука, 1982.

6. Тиунов Л.А., Кустов В.В. Токсикологія окису вуглецю. М:. Міді цина, 1980.