МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
• Методы обнаружения возбудителя в материале от больного
Для обнаружения возбудителя в материале от больного с диагностической целью применяют:
1) микроскопические (бактериоскопические, микоскопичес-кие, вирусоскопические) методы;
2) микробиологические (бактериологические, микологические, вирусологические) методы;
3) биологические методы, или биопробы.
1. Микроскопические методы.Микроскопические методы применяют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) непосредственно в исследуемом материале.
Для выявления бактерий (бактериоскопические исследования), а также грибов и простейших применяют световые методы микроскопии окрашенных или нативных препаратов, приготовленных из материала, полученного от больного (см. тему 1.1 иглаву 2).
Преимущество микроскопических исследований состоит в быстроте (осуществление требует не более 30—60 мин), простоте и дешевизне. Основным недостатком метода является низкая специфичность — невозможность видовой идентификации обнаруженных микроорганизмов, а в ряде случаев — их дифференциации между собой (например, эшерихий, сальмонелл и шигелл). Чувствительность также невысока: микроскопический метод позволяет обнаружить возбудителя при его концентрации не менее 10б микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала.
В большинстве случаев микроскопический метод имеет ориентировочное значение и позволяет получить предварительные данные о микробах, присутствующих в материале, и наметить пути дальнейших исследований. Вместе с тем при некоторых бактериальных инфекциях, а также при микозах и протозой-
ных инфекциях диагностическая ценность микроскопического исследования весьма велика и является основанием для постановки окончательного диагноза заболевания, например возвратного тифа, гонореи, дерматомикозов и др.
Необходимо помнить, что некоторые бактерии (хламидии, микоплазмы) имеют малые размеры, лежащие за пределами разрешающей способности световой микроскопии, и не могут быть выявлены с помощью этих методов.
Вирусоскопические исследования осуществляют с использованием электронной микроскопии (по причине малых размеров вирусов, см. тему 5.1). В сочетании с компьютерными системами анализа изображений эти методы позволяют осуществлять предварительную идентификацию вирусов по морфологии. К числу достоинств метода относится также возможность обнаружения ранее неизвестных вирусов. Чувствительность метода аналогична бактериоскопическому.
Для диагностики инфекций, вызванных облигатными внутриклеточными паразитами, применяют также цитологические методы, направленные на выявление характерного ЦПД в зараженных клетках, например внутриклеточных включений — телец Бабеша—Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболеваниях, вызванных цитомегаловирусом (см. тему 5.2).
2. Микробиологические методы.Основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, и ее последующей идентификации (см. главу 3). Микробиологические методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить его родовую ивидовую принадлежность иосуществить внутривидовое типирование, обнаружить факторы вирулентности, а также определить чувствительность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии.
Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, выделенных от разных больных и из внешних объектов — вероятных источников заражения (вода, пищевые продукты ит.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование, см. тему 10.1), фаговара (фаготипирование, см. тему 5.3) ит.д. Кроме того, микробиологические исследования проводят для выявления носительства патогенных микробов среди детей и взрослых, а также среди работников медицинских учреждений, предприятий пищевой промышленности и общественного питания.
Бактериологическое исследование является ведущим в диагностике большинства бактериальных инфекций. Трудности метода могут быть связаны с низкой скоростью размножения бактерий-возбудителей, сложными ростовыми потреб-
ностями и требовательностью к условиям культивирования (газовому составу атмосферы и т.д.)- Однако только выделение чистой культуры возбудителя из материала от больного при исключении контаминации имеет абсолютное диагностическое
значение.
Микологические исследования осуществляют реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика микозов достаточно надежна. Микологические исследования являются обязательными при диагностике кандидозов, а также глубоких микозов.
Вирусологический метод является наиболее достоверным для диагностики вирусных инфекций. Однако его применение ограничивается трудоемкостью, что связано с особенностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и длительностью культивирования многих вирусов, а также со сравнительно частым получением отрицательных результатов. Идентификацию чистой культуры выделенного вируса осуществляют иммунологическими методами на основании его антигенной структуры, а также в ряде случаев спомощью биохимических и молекулярно-биологических методов (гибридизация НК, рестрикционный анализ и др., см. тему 3.2). Особое значение вирусологический метод приобретает в случае необходимости оценки чувствительности возбудителя к противовирусным препаратам. В ряде случаев вирусологический метод используют для ретроспективной диагностики вирусных
инфекций.
Все микробиологические методы имеют определяющее значение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, являются наиболее информативными и достоверными. К числу недостатков можно отнести длительность (см. главу 3) и отсутствие методов культивирования некоторых микробов (например, возбудителей сифилиса и лепры).
3. Биологические методы (биопробы).Биопробу осуществляют путем заражения лабораторных животных материалом, полученным от больного. Этот метод применяют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорганизмы не растут или плохо культивируются, когда микробиологические методы не дают однозначно положительного результата, а также для дифференциации патогенных микроорганизмов и определения их вирулентности. Дифференциация возбудителей основана на неодинаковой чувствительности разных лабораторных животных к определенным микроорганизмам. В настоящее время биопробы применяют только в случае крайней необходимости, что определяется в первую очередь гуманным отношением к животным, а также связано с повышенным риском заражения персонала диагностической лаборатории.
• Иммунохимические методы диагностики: (методы обнаружения антигенов возбудителя в материале от больного)
1. Метод иммунофлюоресценции (ИФ).Дает возможность
обнаружить в материале от больного антигены микроба с по
мощью специфических антител, меченных флюорохромами
(см. тему 10.1). Этот метод позволяет выявлять и идентифици
ровать по антигенной структуре возбудителей в материале,
содержащем разнообразную микрофлору (например, в испраж
нениях), а также обнаруживать вирусные антигены в заражен
ных клетках. В настоящее время иммунофлюоресцентный ме
тод широко применяют для обнаружения разнообразных мик
роорганизмов в патологическом материале.
2. Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ).Позволяет значительно повысить чувствительность и специфичность вирусо-скопического метода. Исследуемый материал, содержащий свободные вирусные частицы, обрабатывают специфическими антителами. Образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием и агрегаты вирусных частиц выявляют с помощью электронной микроскопии. Существуют также твердофазные методы ИЭМ: специфические антитела фиксируют на специальных сетках для ЭМ, которые затем обрабатывают исследуемым материалом. Вирусные частицы специфически связываются сантителами, после чего их выявляют с помощью электронной микроскопии. В ряде случаев применяют антитела, меченные частицами золота (см. тему 10.1).
3. Другие серологические реакции.Растворимые антигены различных возбудителей (компоненты микробных клеток, ви-рионов, неструктурные вирусные белки, секретируемые зараженными клетками, бактериальные экзотоксины и ферменты и т.д.) могут быть обнаружены в различных биологических жидкостях больного с помощью серологических реакций. Наиболее часто применяют иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунный (РИА) анализ в связи с их высокой чувствительностью, реже используют методы преципитации в геле и непрямой агглютинации (см. тему 10.1).