Микробиологическая диагностика дизентерии
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: фекалии, ректальные мазки, соскобы со слизистой оболочки.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование(схема 13.1.2). Фекалии больного засевают на дифференциально-диагностические среды (агар Эндо, Плоскирева и др.). При наличии в исследуемых испражнениях гнойных или слизисто-кровянистых комочков их выбирают петлей, промывают в изотоническом растворе хлорида натрия и наносят на поверхность питательной среды, после чего растирают шпателем. На 2-й день лактозоотрицательные (прозрачные бесцветные) колонии пересевают на среду Ресселя или на короткий "пестрый ряд" с лактозой и глюкозой.
Среда Ресселя: питательный агар, 1 % раствор лактозы, 0,1 % раствор глюкозы и индикатор бромтимоловый синий. Среду готовят таким образом, чтобы внизу она была в виде столбика, а верхняя часть имела скошенную поверхность. Исследуемую культуру засевают уколом в столбик и на поверхность среды. При ферментации углеводов происходит изменение цвета среды (желтая окраска); разрывы столбика свидетельствуют о газообразовании. Изменение цвета во всем объеме среды наблюдается при ферментации лактозы, только столбика — при ферментации глюкозы, так как содержание ее в среде в 10 раз меньше, чем лактозы. Вместо среды Ресселя можно использовать трехсахарную среду (в ее состав входят глюкоза, лактоза, сахароза, мочевина, некоторые соли и индикатор феноловый красный) или другие дифференциально-диагностические среды, позволяющие различать бактерии по способности ферментировать лактозу и глюкозу.
Оставшуюся часть колоний используют для постановки ориентировочной реакции агглютинации на стекле со смесью дизентерийных сывороток и смесью сывороток против сальмонелл (для исключения брюшного тифа или сальмонеллеза). Окончательное заключение дают на 4-й день по результатам ферментативных тестов (табл. 13.1.2) и реакции агглютинации. Выделенную чистую культуру используют для определения чувствительности возбудителя кантимикробным препаратам.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Таблица 13.1.2. Биохимические признаки бактерий рода Shigella
| Группа | Ферментация | Образование индола | Декар-бокси-лирова-ние ор-нитина | ||||
| глюкозы с газообразованием | лактозы | ман-нита | дуль-цита | ксилозы | |||
S.dysenteriae _____ в —
S.flexneri — — + — — в —
S.boydii — — + — в в —
S.sonnei — [+] + [+] в — +
Условные обозначения: (+) —положительная реакция; (^ — отрицательная реакция; [+] — поздняя реакция; в — вариабельная реакция.
Серодиагностика. Применяют для ретроспективного обоснования диагноза дизентерии при стертых и хронических формах. Ставят развернутую реакцию агглютинации по типу реакции Видаля и РИГА с эритроцитарными диагностикумами Флекс-нера и Зонне. Диагностическим титром при дизентерии, вызванной шигеллами Флекснера, считают разведение 1:200, а шигеллами Зонне — 1:100.
• Микробиологическая диагностика геликобактериоза
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптат из пораженного участка слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование. Обнаружение возбудителя в гистологических препаратах, окрашенных по методу Романовского—Гимзы, Грама, гематоксилин-эозином и др., а также с помощью фазово-контрастной и электронной микроскопии. Helicobacter pylori — мелкие грамотрицательные изогнутые, S-образные или спиралевидные (2—3 завитка) бактерии. H.pylori имеют 4—6 жгутиков, расположенных на одном из полюсов — лофотрихи.
Бактериологическое исследование. Посев на богатые питательные среды ("шоколадный агар" и др.), содержащие гемоли-зированную кровь, сердечно-мозговой настой, дрожжевой экстракт и антимикробные препараты (ванкомицин, налидиксо-вую кислоту и амфотерицин В) для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Инкубация посевов осуществляется при 37 °С в микроаэрофильных условиях (в атмосфере, содержащей не более 5 % 02 и 10 % С02) при повышенной влажности в течение 7 сут. Рост колоний обычно наблюдается на 3—4-е сутки. Идентификация чистой культуры осуществляется на основании морфологии, подвижности, культуральных, биохими-
ческих признаков, чувствительности к антимикробным препаратам.
Типирование штаммов возбудителей для эпидемиологического анализа проводят методом рестрикционного анализа ДНК.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования: биохимические исследования. Выявление бактериального фермента уреазы.
♦ Определение уреазной активности в биоптате. Биоптат
помещают в бульон, содержащий мочевину и индикатор.
В положительных случаях происходит изменение цвета
индикатора в результате защелачивания среды при гид
ролизе мочевины с образованием аммиака.
♦ Дыхательный тест на уреазу. После перорального приема
мочевины, меченной радиоактивным изотопом 14С, оп
ределяют присутствие меченой двуокиси углерода 14С02
в выдыхаемом воздухе. Появление 14С02 свидетельствует
об активности уреазы (результат гидролиза меченой мо
чевины), что является косвенным признаком присутст
вия в желудке или двенадцатиперстной кишке H.pylori.
Тест используют преимущественно для предварительной
диагностики и контроля результатов лечения.
Молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Диагностическое значение имеет обнаружение антител к поверхностным антигенам возбудителя и уреа-зе. Используют методы: ИФА, РИА и РИГА.
• Микробиологическая диагностика кампилобактериозов
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения, ректальные мазки, при генерализованной форме инфекции — кровь, спинномозговая жидкость. При необходимости хранения материал помещают в транспортную среду (буферный солевой раствор с добавлением нейтрального угля и метиленово-го синего или тиогликолевый бульон) при температуре 4 "С, что позволяет микробам сохранять жизнеспособность до 4 сут.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическая диагностика. Производят посев на специальные плотные среды, обогащенные аминокислотами с добавлением гемолизированной крови или нейтрального угля (для удаления токсичных метаболитов кислорода) и 3—5 антибиотиков для подавления роста сопутствующей микрофлоры (обычно используют ванкомицин, полимиксин, триметоприм,
амфотерицин В и др.). Инкубация посевов осуществляется при 42 "С в микроаэрофильных условиях — в атмосфере, содержащей не более 5 % 02 и 10 % С02. Рост колоний наблюдается через 48—72 ч. Идентификация чистой культуры осуществляется на основании морфологии: мелкие грамотрицательные S-образно или спиралевидно (2—3 завитка) изогнутые микроорганизмы, моно- или амфитрихи; используют темнопольный и фазово-контрастный методы исследования для выявления характерной подвижности — штопорообразные движения, куль-туральных, биохимических признаков, чувствительности к антимикробным препаратам. Разработаны также биохимические (хемоидентификация) и молекулярно-биологические методы идентификации (см. главу 3).
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно'поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Применяют преимущественно для ретроспективной диагностики — антитела определяют в парных сыворотках в реакциях РСК, РИГА и др.
• Диагностические, профилактические и лечебные препараты
Агглютинирующие ОВ-сыворотки против патогенных кишечных палочек: ОВ-коли-сыворотка 026:В6, ОВ-коли-сыворотка 0111: В4, ОВ-коли-сыворотка 055:В5 и др. Получают путем иммунизации кроликов взвесью эшерихий соответствующего серовара и применяют в реакции агглютинации для идентификации патогенных эшерихий.
Адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентификации шигелл. Различают групповые и моновалентные сыворотки. Получают путем иммунизации кроликов определенными видами и сероварами S.dysenteriae, S.flexnery, S.sonnei и S.boydi с последующей адсорбцией межгрупповых и других лишних антител.
Поливалентный дизентерийный бактериофаг. Содержит фаги, лизирующие шигеллы Флекснера и Зонне. Выпускается в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием. Применяют для экстренной профилактики и лечения.
Дизентерийная вакцина спиртовая, сухая. Содержит шигеллы Флекснера и Зонне. Применяют для лечения хронических форм дизентерии.
Препараты эубиотиков — коли-бактерин, бифидумбактерин, бификол, лактобактерин. Применяют с лечебно-профилактическими целями (см. тему 13.2).
Антибиотики: полусинтетические пенициллины, цефалоспо-рины 2—4-го поколений, хлорамфеникол, тетрациклины, фторхинолины, сульфаниламиды, полимиксин и др.
Тема 13.2. ВОЗБУДИТЕЛИ БРЮШНОГО ТИФА, ПАРАТИФОВ И ИЕРСИНИОЗОВ. ДИСБАКТЕРИОЗ
Современная классификация бактерий рода Salmonella. Род
Salmonella включает 2 вида: S.enterica (2307 сероваров) и S.bon-gori (17 сероваров). Вид S.enterica включает 5 подвидов: enterica (I), salamae (II), arizonae (Ilia), diarisonae (Illb), houtenae (IV), indica (V), которые выделены на основании молекулярно-гене-тических признаков (гибридизационного анализа ДНК) и фе-нотипически различаются по биохимическим свойствам. Внутри подвидов сальмонеллы подразделяются на серовары по О-и Н-антигенам согласно классификации Кауфмана—Уайта. Необходимо помнить, что представители разных подвидов могут иметь общие или идентичные антигены. Абсолютное большинство сероваров (1367) относятся к подвиду enterica. Согласно ранее существовавшей классификации, сальмонеллы — представители различных сероваров — рассматривались как самостоятельные виды и имели собственные видовые названия. В настоящее время старые видовые названия используют для обозначения биоваров (сероваров), например S.enterica подвида enterica серовара typhimurium соответствует S.typhimurium, серовара typhi — S.typhi, серовара paratyphi A — S.paratyphi Л и т.д. Природным резервуаром бактерий S.enterica подвида enterica являются теплокровные животные, для остальных — холоднокровные животные и окружающая среда. Возбудители заболеваний человека относятся к подвиду enterica.
С эпидемиологической точки зрения сальмонеллы, вызывающие заболевания человека, относят к трем основным группам. Первая группа включает 3 биовара: typhi, paratyphi А и С, которые являются возбудителями строгих антропонозов (инфицируют только человека и передаются от человека к человеку прямо или опосредованно — через пищу, воду). Вторая группа включает серовары, которые адаптировались к определенному виду животных. Некоторые из этих сероваров патогенны для человека (dublin, gallinarum, schottmulleri и др.). К третьей группе относятся большинство сероваров, не имеющих специфических хозяев и способных инфицировать как человека, так и животных. По клинической классификации сальмонеллы подразделяют на возбудителей брюшного тифа (биовар typhi) и паратифов (биовары paratyphi А, С и schottmulleri) и возбудителей сальмонеллезов, включающих все остальные биовары сальмонелл, патогенных для человека. Большинство возбудителей сальмонеллезов относится к третьей группе по эпидемиологической классификации.
а План
Программа
1. Биологические свойства возбудителей брюшного тифа, паратифов и иерсиниозов. Их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний. Дисбактериоз.
2. Лабораторная диагностика.
3. Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
А Демонстрация
1. Мазки из чистых культур возбудителей кишечных инфекций: Salmonella enterica биоваров typhi, paratyphi A, typhimurium, Proteus vulgaris. Окраска по методу Грама.
2. Диагностические и лечебно-профилактические препараты.
А Задание студентам
1.Микроскопировать и зарисовать мазки из чистых культур возбудителей кишечных инфекций.
2. Лабораторная диагностика кишечных инфекций.
2.1. Диагностика брюшного тифа и паратифов.
А. Бактериологическая диагностика:
1) выбрать материал для исследования;
2) учесть результаты первичного посева исследуемого материала на среду Раппопорт;
3) учесть результаты пересева бактерий со среды Раппопорт на среду Эндо. Описать и зарисовать колонии, выросшие на среде Эндо, и обосновать выбор подозрительных колоний для дальнейшего исследования;
4) учесть результаты пересева подозрительных колоний со среды Эндо на среду Ресселя;
5) учесть результаты идентификации выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам;
6) сделать вывод и наметить план дальнейшего исследования.
Б. Серодиагностика. Проанализировать результаты реакции Видаля.
2.2. Бактериологическая диагностика сальмонеллезов:
1) выбрать материал для исследования;
2) учесть результаты первичного посева исследуемого материала на висмут-сульфит агар. Описать и зарисовать колонии и обосновать выбор подозрительных колоний для дальнейшего исследования;
3) учесть результаты пересева подозрительных колоний на среду Ресселя;
4) учесть результаты идентификации выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам;
5) сделать вывод и наметить план дальнейшего исследования.
3. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилактическими препаратами.
А Методические указания
• Микробиологическая диагностика брюшного тифа и паратифов
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: исходя из особенностей патогенеза брюшного тифа, на 1-й неделе заболевания, в период бактериемии, возбудителей выделяют из крови (получение гемокультуры), со 2-й недели заболевания — из испражнений (получение копрокультуры), мочи или желчи.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование(схема 13.2.1).
Получение гемокультуры. В 1-й день из локтевой вены больного берут 5—10 мл крови и засевают в колбу с 50—100 мл селективной среды Раппопорт, содержащей желчный бульон (для подавления роста других бактерий), глюкозу, индикатор Андреде и поплавок для обнаружения газа. Указанные соотношения крови и среды необходимы для подавления бактерицидного действия белков крови. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—20 ч. На 2-й день при росте сальмонелл наблюдается помутнение и изменение цвета среды. При росте паратифозных бактерий (биовары paratyphi А, Си schottmuelleri) наряду с указанными изменениями появляются пузырьки газа в поплавке. Для ускорения ответа из среды Раппопорт делают мазки и препараты "висячая" капля. При наличии чистой культуры грамотрицательных подвижных палочек и изменении цвета среды (или наличии газа) дают первый предварительный ответ. Затем культуру из среды Раппопорт пересевают в пробирку со средой Ресселя, полагая при этом, что из крови выделена чистая культура и можно сразу приступить к ее идентификации. Одновременно со среды Раппопорт делают посевы на среду Эндо для получения изолированных колоний с целью проверки чистоты выделенной культуры.
На 3-й день отмечают ферментацию глюкозы на среде Ресселя и ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле. На основании полученных данных дают второй предварительный ответ. Для дальнейшего исследования отбирают несколько бесцветных колоний со среды Эндо и пересевают их в среду Ресселя или скошенный питательный агар (для контроля полученных результатов). Чистую культуру пересевают на среды "пестрого" ряда и серотипируют в реакции агглютинации на стекле со смесью групповых сывороток, а затем с
|
адсорбированными монорецепторными О- и Н-сальмонеллез-ными сыворотками. Окончательный диагноз устанавливают на основании биохимических (табл. 13.2.1) и антигенных свойств.
Таблица 13.2.1. Биохимические свойства сальмонелл — возбудителей брюшного тифа и паратифов
| Биовар S.enterica | Ферментация | Образование | ||||||
| лактозы | глюкозы | мальтозы | сахарозы | ман-нита | H2S | NH3 | индола | |
Typhi - К К - К + -
Paratyphi А - КГ КГ - КГ - -
Schottmuelleri — КГ КГ - КГ + +
Условные обозначения: К — образование кислоты; КГ — образование кислоты и газа; (+) — обнаружение признака; (—) — отсутствие признака.
Биохимические признаки (развернутый "пестрый" ряд) позволяют дифференцировать сальмонеллы от схожих сними энтеробактерий: Citrobacter, Hafnia (табл. 13.2.2).
Таблица 13.2.2. Дифференциация сальмонелл и других энтеробакте рий по биохимическим признакам
| Род | Лизин- декар- бокси- лаза | Ферментация углеводов | р- Галак-този-даза | |||||
| дуль-цита | сорбита | ксилозы | рам-нозы | салицина | 4% лактозы | |||
Salmonella ± К(-) К К К - - -
Citrobacter - К(-) К К К К(±) К(±) К
Hafnia + - - К К К(+) - К
Условные обозначения: (+) — положительная реакция; (—) — отрицательная реакция; ± — вариабельная реакция; К — образование кислоты; К(—) — образование кислоты (редко); К(±) — образование кислоты (вариабельно).
Выделенную чистую культуру бактерий используют для определения чувствительности к антимикробным препаратам.
Фаготипирование. С помощью набора стандартных Vi-фагов определяют до 78 фаготипов S.enterica биовара typhi. При этом необходимым условием является наличие в культуре FZ-антигена. Культуры S.enterica биовара paratyphi В (schottmuelleri) дифференцируются на11 фаготипов и подтипов.
Получение копрокультуры. Испражнения засевают на одну из дифференциально-диагностических сред (Эндо или Левина) или элективные среды обогащения (Мюллера, селени-
товая или висмут-сульфит агар). Для посева петлю фекалий вносят в пробирку с изотоническим раствором хлорида натрия и готовят суспензию. После оседания крупных комочков суспензию петлей наносят на поверхность агаровой среды — на одну половину чашки. Материал тщательно растирают шпателем по одной, а затем по другой половине чашки для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—20 ч. На 2-й день изучают характер колоний, выросших на чашках (рис. 13.2.1; на вклейке), пересевают 2—3 бесцветные колонии (со среды Эндо или Левина) или колонии черного цвета (висмут-сульфит агар) на среду Ресселя и в пробирки со скошенным питательным агаром. При отсутствии подозрительных колоний на чашках делают высевы из среды Мюллера или селенитовой среды на чашки со средой Эндо для получения изолированных колоний. Для ускорения ответа ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с материалом, взятым из бесцветной колонии. Далее поступают так же, как и при идентификации гемокультуры.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.Молеку-лярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Влабораторной практике широко применяют развернутую реакцию агглютинации Видаля, основанную на обнаружении в сыворотке крови людей антител — агглютининов, которые появляются в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания. Реакцию ставят одновременно с четырьмя антигенами: О- и Н-брюшнотифозными, А- и В-паратифозными диагностикумами. Брюшнотифозные монодиагностикумы применяют для установления стадии болезни, так как содержание О- и Н-антител в разные ее периоды неодинаково. О-антитела появляются на 1-й неделе, накапливаются в разгар заболевания и исчезают к моменту выздоровления. Н-антитела появляются в разгар заболевания, накапливаются к концу заболевания и сохраняются у переболевших в течение длительного времени. У людей, вакцинированных против брюшного тифа и парати-фов, также наблюдается положительная реакция Видаля, причем в довольно высоком титре, поэтому "инфекционный Ви-даль" удается отличить от "прививочного" только по нарастанию титра агглютининов у больных в процессе заболевания. Реакцию Видаля ставят в четырех рядах пробирок по 7 пробирок в каждом ряду, из которых 5 опытных и 2 контрольные. Для контроля каждого диагностикума в пробирки вносят по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в который добавляют 2 капли диагностикума. В контрольной пробирке с
1 мл сыворотки (без диагностикума) не должно быть хлопьев. При спонтанной агглютинации реакция не учитывается. Диагностический титр реакции Видаля равен 1:200. Для серологического исследования реконвалесцентов и выявления бактерионосителей широко используют реакцию непрямой И-гемаг-глютинации, с помощью которой в сыворотке крови людей определяют присутствие антител к К/-антигену. В качестве антигена используют эритроцитарный Р?-диагностикум, представляющий собой взвесь эритроцитов человека 1(0) группы, обработанных формалином и сенсибилизированных Fz'-антиге-ном S.enterica биовара typhi. Готовят разведения испытуемой сыворотки от 1:10 до 1:1280. При положительной реакции эритроциты покрывают дно пробирки в виде диска с зазубренными краями, а надосадочная жидкость остается прозрачной. При отрицательной реакции, так же как и в контроле, эритроциты осаждаются на дно пробирки и имеют виддиска с ровными краями ("пуговки"). Диагностическое значение имеет титр пассивной Й-гемагглютинации, начиная с 1:40 и выше. Всех лиц, сыворотка крови у которых дает положительный результат в РНГА с эритроцитарным F/f-диагностикумом, рассматривают как подозрительных на носительство S.enterica биовара typhi и подвергают многократному бактериологическому обследованию.