Определение экспрессии гена fum1 и fum2 в листьях кукурузы в условиях гипоксии
В ходе работы нами была экстрагирована тотальная РНК из зеленых листьев кукурузы по средству гуанидин-тиоционатного метода. Используя данную методику, нам удалось получить высокоочищенную суммарную клеточную РНК, анализ которой проводился в 1% агарозном геле (рис 3). После чего полученную РНК использовали в реакции обратной транскрипции с целью получения кДНК. Уровень экспрессии генов fum1 и fum2, отвечающих за кодирование двух отличных друг от друга изофермента фумаратгидротазы, оценивался с помощью метода ПЦР в реальном времени, который позволил нам выявить содержание исследуемого фермента в образце.
Рис. 3. Аналитический электрофорез тотальной РНК из листьев кукурузы
Проведенный анализ образцов кДНК из кукурузы с праймерами к гену fum1 в условиях нормы и гипоксии позволил установить, что в растениях, находящихся в кислородной среде относительная концентрация мРНК исследуемого гена практически не изменялась на протяжении 24 часов инкубации оставаясь на уровне 4,5-4,7 относительных единиц. Значительно большее разнообразие для данного показателя было обнаружено в растениях, находящихся условиях углекислого газа. К 3 часу экспозиции уровень транскриптов гена fum1 увеличился относительно контрольной точки (0 часов экспрозиции) в 1,47 раза, после чего в последующие часы наблюдалось резкое снижение величины исследуемого показателя. К 24 часам инкубации в среде углекислого газа значение относительной транскрипции гена fum1 составляло 0,3 относительные единицы. Аналогичная ситуация наблюдается при инкубации растений в условиях азота. Интенсивность транскрипции гена fum1 в первые 3 часа увеличилась на 1,48 раза, но в последующем так же, уровень относительной транскрипции снижался до значения 1,1 отн. ед. (рис. 4).
Рис. 4. Относительный уровень транскрипции гена fum1 в листьях кукурузы в разных экспериментальных условиях.
Полученные результаты по влиянию углкислого газа и азота на уровень транскрипции гена fum2 фумаратгидратазы в листьях кукурузы свидетельствуют, что в нормальных условиях не происходит изменения в концентрации транскриптов данного гена. Углекислый газ и азот вызывает изменения в работе генетического аппарата клетки, приводящих к уменьшению количества мРНК fum2 в клетках растений. Значительно выраженный эффект наблюдается в условиях азота, что проявляется в резком снижении скорости транскрипции гена fum2 уже к 3 часу эксперимента (рис 5). Уровень относительный транкрипции для исследуемого гена на 3 час инкубации составил 9,1 отн. ед., что в 1,91 раза меньше контроля. Аналогичный эффект на экспрессию гена fum2 вызывает действие углекислого газа, однако скорость изменения данного показателя значительно медленнее.
Рис. 5. Относительный уровень транскрипции гена fum1 в листьях кукурузы в разных экспериментальных условиях.
Полученные результаты по изучение влияния газового состава среды на уровень транскрипции генов фумаразы в листьях кукурузы свидетельствуют, что углекислый газ и азот вызывает уменьшение количества мРНК генов fum1 и fum2. Полученные данные по скорости транскрипции генов фумаратгидратазы коррелируют с изменением ее активности в условиях гипоксии. Вероятно, полученные данные могут свидетельствовать, что регуляция скорости функционирования фумаратгидратазы в условиях гипоксии регулируется за счет изменения скорости транскрипции ее генов fum1 и fum2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные данные по динамике активности фумаратгидратазы позволяют оценить изменение скорости функционирования ЦТК и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме в условиях дефицита кислорода. В условиях гипоксии метаболизм растительного организма существенно меняется, что проявляется в изменении скорости функционирования фумаратгидратазы. Резкое повышение активности исследуемого фермента в начале эксперимента может быть объяснено действием диоксида углерода как специфического стрессового фактора, способствующего мобилизации всех обменных процессов, однако при более длительном воздействии потенциал организма иссякает. Происходит резкая активизация всех метаболических процессов, в том числе и ЦТК, что подтверждается активной работой исследуемого фермента, свидетельствующей о высокой скорости функционирования цикла Кребса.
Исследование изоферментного состава ФГ показало наличие двух форм фермента в листьях кукурузы, цитозольной и митохондриальной. Поскольку специфическое проявление фумаразы в листьях кукурузы в условиях различной газовой среды показало однородность изоферментного состава, мы можем сделать вывод о том, что изменение активности фумаратгидротазы не связано с изменением количества изоформ.
Также нами было проведено исследование уровня экспрессии генов fum1 и fum2 в листьях кукурузы в условиях различного состава газовой среды. Для генов fum1 и fum1 экспрессия была стабильна на протяжении всего эксперимента в кислородсодержащей среде. В условиях углекислого газа скорость транкрипции исследуемых генов имела дифференциальный характер. Активность гена fum2 снижалась на протяжении всего эксперимента, а для fum1 характерно увеличение экспрессии на 3 день экспозиции растений Данный количестввенной ПЦР соотносятся с динамикой активности фермента, что позволяет предположить механизм ее регуляции на генетическом уровне.
ВЫВОДЫ
1. Полученные данные по динамике активности фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы в условиях гипоксии, свидетельствуют об ингибировании митохондриального дыхания. Возрастание данного показателя в первые часты в условиях углекислого газа, вероятно, связано с необходимостью мобилизации всех обменных процессов для адаптации к стрессовым условиям.
2. Исследование изоферментного состава ФГ показало однородность изоферментного состава в листьях кукурузы в различной газовой среды, свидетельствующее об отсутствии зависимости изменения активности фумаратгидротазы от количества форм в стрессовых условиях.
3. Полученные результаты по изучение влияния газового состава среды на уровень транскрипции генов фумаразы в листьях кукурузы свидетельствуют, что углекислый газ и азот вызывает уменьшение количества мРНК генов fum1 и fum2., что, вероятно, может свидетельствовать о регуляции скорости функционирования фумаратгидратазы в условиях гипоксии на уровне экспрессии генов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Войцековская С.А., Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С., Зайцева Т.А. Активность некоторых ключевых ферментов метаболизма в зеленых проростках ячменя при гипобарической гипоксии// Вестник Томского государственного университета. 2007. №297. с. 181-183