Робота № 2. Підрахунок кількості еритроцитів в крові
Еритроцити підраховують за допомогою лічильної камери Горяєва під мікроскопом.
Сітка лічильної камери складається з 225 великих квадратів, із яких 25 розділені на 16 маленьких. Сторона одного маленького квадрата дорівнює 1/20 мм, площа – 1/400 мм2, висота камери (відстань від дна до покривного скла) – 1/10 мм. Таким чином, об’єм камери над маленьким квадратиком становить 1/400 мм3 (1/4000 х 1/10).
Кров для підрахунку еритроцитів розводять у спеціальних змішувачах - капілярних піпетках з ампульним розширенням. На змішувачах для еритроцитів є помітки 0,5 та 101. Помітка 0,5 означає, яку частину об’єму всього змішувача займає даний стовпчик капіляра, заповнений кров’ю. Цей об’єм вміщує 1/200 частину повного об’єму змішувача. Таким чином, кров розбавляється в 200 разів.
Розбавляти кров у 200 разів можна й іншими методами. Наприклад: у пробірку налити 4 мл 5% розчину натрію цитрату й за допомогою мікропіпетки додати туди 20 мкл крові. Обов’язково треба двічі сполоснути мікропіпетку в названому розчині, щоб вся кров потрапила в пробірку.
Мета роботи: познайомитись з принципом підрахунку кількості еритроцитів у лічильній камері Горяєва. Підрахувати еритроцити за допомогою цього методу. Дати оцінку кількості еритроцитів, що містяться в периферичній крові досліджуваного.
Для роботи потрібні: мікроскоп, освітлювач, камера Горяєва, покривне скло, змішувач для червоної крові, пробірка, 3% розчин натрію хлориду, голка, 96% спирт, 2% розчин йоду спиртовий, вата, гумова груша, 5% розчин натрію цитрату, мікропіпетка місткістю 20 мкл.
Хід роботи. Покласти скло камери Горяєва під об’єктив мікроскопа й роздивитись сітку камери під великим та малим збільшенням. Накрити камеру покривним склом. Гумову грушу надіти на верхній отвір змішувача (меланжера). Налити 1 – 1,5 мл 3% розчину натрію хлориду в робочу пробірку. Занурити кінець змішувача у емкість з досліджуваної кров”ю й набрати крові до помітки 0,5. Якщо набрано більше крові, то за допомогою сухого ватного тампона доторкуючись до носика, зняти лишок крові. Занурити кінчик змішувача в 3% розчин натрію хлориду, що налитий у робочу пробірку, і за допомогою гумової груші набрати його в меланжер до помітки 101. Таким чином кров буде розведена у 200 разів.
Обережно струшуючи змішувач, перемішати розчин крові в його ампулі. В ній є для цього маленька червона намистинка. Перші дві краплі розчину, що йдуть з капіляра меланжера, видути на вату, а наступні краплі з ампульного розчину помістити в камеру. Для цього кінчик меланжера поставити на край камери біля покривного скла й легенько натиснути на грушу. Розчин зайде під покривне скло в камеру і заповнить її. Почекати 1 – 2 хвилини щоб еритроцити осіли на дно камери. При малому збільшенні мікроскопа знайти сітку камери. Перевести мікроскоп на велике збільшення й почати підрахунок еритроцитів у 5 великих квадратах, що розділені на маленькі. Найкраще лічити еритроцити у великих квадратах, що містяться по діагоналі поля зору. Під час підрахунку еритроцитів треба пам’ятати правило Бюркера: у маленьких квадратах рахувати ті клітини, що містяться посеред квадрата сітки, та також на його верхньому та лівому боках. Це потрібно для того, щоб двічі не рахувати еритроцити, що містяться на боках суміжних квадратиків.
Рекомендації щодо оформлення результатів роботи. Кількість еритроцитів у 1 мкл крові розраховують за формулою:
а х 4000 х 200
Х = ______________ .
Де Х – кількість еритроцитів у 1 мкл; а – кількість еритроцитів у 80 малих квадратах; 80 – кількість підрахованих малих квадратів (5 х 16 = 80); 200 – ступінь розрідження крові; 4000- множинник , що приводить результат до об’єму 1мкл крові, оскільки об’єм малого квадратика становить 1/400 мкл.
Практично кількість еритроцитів визначають у 80 малих квадратах, одержаний показник множать на 10 000. Для визначення кількості еритроцитів за Cl – T (тера) в 1 л – отриману цифру множать на 106 .
У протоколі відобразити процес розрахунку. Після остаточного розрахунку має бути вказана кількість еритроцитів у 1 л крові.
У висновках відповісти на запитання, чи нормальна кількість еритроцитів у досліджуваній крові?