Побудова калібрувального графіка
Для розрахунку протеолітичної активності необхідно побудувати калібрувальну криву по тирозину. Потім по калібрувальній кривій вирахувати тирозиновий еквівалент ТЕ, тобто ту оптичну густину, котру дав би 1мкМ тирозину в 1мл стандартного розчину. Цей еквівалент необхідно встановити для кожної нової партії реактиву Фоліна і кожного фотоелектроколориметра.
Для побудови калібрувального графіка готують розчини тирозину з концентрацією 10-3М. Для цього наважку 181,19мг чистого тирозину розчиняють в 0,2н. розчині хлористоводневої кислоти HCl в мірній колбі 1 л (готують 2 паралельні проби). З цього вихідного розчину готують подальші розведення таким чином:
Розчин 1
В мірну колбу на 50мл вносять 1 мл початкового розчину тирозину і доводять об’єм до мітки 0,2н розчином хлористоводневої кислоти HCl. Концентрація тирозину С1 при цьому становитиме 0,2∙10-4М, або 0,02мкмоль/мл.
Розчин 2
2 мл початкового розчину; С2=0,4∙10-4М, або 0,04мкмоль/мл.
Розчин 3
4 мл початкового розчину; С3=0,8∙10-4М, або 0,08мкмоль/мл.
Розчин 4
5 мл початкового розчину; С4=1,0∙10-4М, або 0,10мкмоль/мл.
Розчин 5
7,5 мл початкового розчину; С5=1,5∙10-4М, або 0,15мкмоль/мл.
Розчин 6
10 мл початкового розчину; С6=2,0∙10-4М, або 0,20мкмоль/мл.
Розчин 7
15 мл початкового розчину; С7=3,0∙10-4М, або 0,30мкмоль/мл.
Потім в ці пробірки вносять по 1мл розчину тирозину різної концентрації. Додають в них при постійному перемішуванні по 5мл 0,5 М розчину карбонату натрію Na2CO3 і 1мл робочого розчину Фоліну. Контрольний аналіз готують так само, але замість розчину тирозину беруть 1 мл дистильованої води. Реакційна суміш видержується 20 хв.
Інтенсивність кольору досліджуваного розчину визначають по порівнянню з контрольним при довжині світової хвилі 656-670 нм в кюветах з товщиною поглинаючої стінки світло 10 мм. По середнім даним, одержаних в двух аналізах, будують калібрувальний графік
На осі абсцис відкладається кількість тирозину С (в мкмоль/мл), а на осі ординат - відповідні значення оптичної густини.
Протеолітичну активність ПС (в од/г, або од/мл) розраховують по формулі:
ПС= 
ОД/г, де:
D - оптична густина
4 – відношення об‘ємів реакційної суміші і розчину ферменту після при бавлення ТХО;
1000 – коефіцієнт переводу одиниць на 1г ферментного препарату;
ТЕ – тиризований еквівалент, визначений по калібрувальному графіку;
10 - час гідролізу субстрату, хв;
m- кількість ферментного препарату , який взятого на протеоліз, мг на 1 мл ферментного розчину
Реактиви
1.Універсальний буферний розчин 0,1М
1.1.Розчин А – 0,1 М розчин оцтової кислоти
1.2.Розчин В – 0,1 М розчин ортофосфорної кислоти Н3РО4
1.3.Розчин С – 0,1 М розчин ортоборної кислоти Н3ВО3
1.4.Розчин їдкого натру NаОН 1N розчин
2.Універсальний буферний розчин 0,01М.
3.Розчин ТХО Cl3CCOOH 0,3М розчин
4.Хлористоводнева кислота НCl 1N розчин
5.Натрій вуглекислий Nа2СО3∙0,5м розчин
6.Основний реактив Фоліна
7.Робочий реактив Фоліна
8.Хлористоводнева (соляна) кислота НCl 0,2N розчин
Посуд та обладнання
1.Ваги аналітичні
2.Пробірки сухі та хімічно чисті
3.Піпетки на 1, 2 і 5 мл
4.Ультратермостат на 30оС
5.Лійки Ø 40-50 мм
6.Фільтрувальний папір
7.Фотоелектроколориметр
8.Кювети з товщиною стінки 10 мм