Реакция связывания комплемента
(РСК) - серол. реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих Ат и Аг. Принцип РСК состоит в том, что специфический иммунный комплекс полностью или частично адсорбирует добавленный в систему С. В качестве количественного индикатора связывания С берут гемолитическую систему, гемолиз к-рой указывает на отсутствие иммунного комплекса в диагностической системе (отрицательная РСК), задержка гемолиза - на присутствие иммунного комплекса (положительная РСК). В РСК применяют: 1) прогретую при 57 °С 30 мин иссл. с-ку, она должна быть свежей, без взвешенных частиц, цитотоксинов, С. В опыт обычно берут несколько кратных 2 разведении с-ки в зависимости от диагностического титра РСК при предполагаемом заболевании; 2) диагностикум продажный или специально приготовленный для РСК; 3) С в рабочей дозе, к-рая при титровании с Аг равна титру С, а при титровании без Аг - выше титра С на 20 - 25%; 4) эритроциты барана отмывают несколько раз физраствором и готовят 3% взвесь; 5) гемолитическую с-ку разводят в 3 раза меньше титра, указанного на этикетке. Все 5 компонентов берут в одинаковом объеме (0,5 мл или 0,25 мл). В опытную (диагностическую) систему вводят иссл. с-ку, диагностикум, С. Готовят контроли: с-ки - с-ку, С и физраствор (вместо Аг); диагностикума -диагностикум, С и физраствор (вместо с-ки); С- С и двойной объем физраствора; заведомо положительный -стандартная иммунная с-ка, Аг, С; заведомо отрицательный - нормальная с-ка, Аг, С. Пробирки встряхивают и ставят в термостат при 37 °С на 45 мин. Одновременно заготавливают гемолитическую систему, смешивая равные объемы 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической с-ки, и инкубируют ее в термостате такое же время. После сенсибилизации во все опытные и контрольные пробирки добавляют двойной объем гемолитической системы (1 мл или 0,5 мл). Все пробирки выдерживают в термостате при 37°С до появления полного гемолиза в контрольных пробирках (около 30 - 40 мин). При количественном способе постановки реакции находят разведение, в к-ром имеется задержка гемолиза не менее чем на 2+ (титр Ат иссл. с-ки) и сравнивают его с диагностическим титром распознаваемой болезни. Полуколичественный способ с одним разведением с-ки (обычно 1:5) дает возможность определить степень задержки гемолиза на 4+, 3+, 2+ и, исходя из этого, оценить интенсивность реакции. Более точные результаты представляет нахождение титра с-ки не по 100%, а по 50% гемолизу (см. Комплемента определение).Предложен вариант количественной постановки РСК, в к-ром берут одно разведение с-ки, но несколько доз С (1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4). Все остальные компоненты используют в таких же количествах. При оценке имеют в виду то обстоятельство, что чем больше доз С связывает иссл. с-ка, тем больше в ней Ат.
РСК ставят в различных объемах: в общем объеме 1 мл — берут 0,2 мл каждого компонента, в общем объеме 0,5 мл — берут 0,1 мл каждого компонента или микрометодом — общий объем 0,125 мл, при этом каждый компонент равен 0,025 мл.
Приготовление антигена вируса ящура.
Стенки афт от больных животных отмывают от консервирующей жидкости физиологическим раствором рН 7,4—7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательно растирают в фарфоровой ступке со стерильным битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, к которой добавляют двойное по отношению к массе афт количество физиологического раствора (Dii 7,4—7,6), т. е. на 1г афт —2 мл раствора. Полученную 33% суспензию экстрагируют при комнатной температуре 2 ч, промц раживают при минус 10 — 20 "С в течение 5 — 18 ч. После размораживания центрифугируют 15—30 мин при 3000—5000 мин-1. Надосадочную жидкость инактивируют при 58 °С 40 мин. После инактивации, если в жидкости остаются хлопья, ее центрифугируй повторно 10—15 мин при 3000 мин-1 и затем используют в качестве антигена в РСК.
Этапы постановки РСК.
Титрование гемолизина. Проводят при получении новой серии по общепринятой методике. В главный опыт берут гемолизин в 4-кратной концентрации от его предельного титра (рабочее разведение).
Приготовление гемолитической системы (гемсистемы). Для этого смешивают гемолизин в рабочем разведении с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана.
Титрование комплемента. Проводят в гемолитической системе в день постановки главного опыта по общепринятой методике. Для главного опыта РСК комплемент берут с излишком в 1 % от его титра в гемсистеме. Правильно взятая рабочая доза комплемента — непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.
Приготовление рабочего разведения типоспецифических сывороток. В главный опыт для определения типа вируса ящура сыворотки используют в удвоенном титре (от предельного титра), например, если предельный титр сыворотки составляет 1 :40, то рабочий титр будет 1 : 20.
Приготовление рабочего разведения типоспецифических антигенов. Антигены также используют в удвоенных титрах, например, если предельный титр равен 1 : 6, то рабочий титр будет 1 : 3.
Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным ( 33%-ная взвесь) и в разведениях 1:2, 1:4 и 1:8.
Примечание. По представленным результатам все стандартные антигены и сыворотки активны и типоспецифичны. Испытуемый антиген относится к типу А.
Учет реакции ведут через 5 — 10 мин после водяной бани, и окончательный результат получают через 10— 12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: (++++) — 100%-ная задержка гемолиза; (+++) — 75%-ная; (++) — 50%-ная; (+) — 25%-ная задержка гемолиза; (-) — полный гемолиз.
Если испытуемый антиген гомологичен специфическим антителам, то будет задержка гемолиза и реакция будет положительной; если же гомологичные антитела отсутствуют, реакция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.
При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном. Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разв Едениях .
Заключение. Испытуемый штамм относится к варианту A22.
Когда доставленного из хозяйства вирусного материа недостаточно для исследования в РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3-6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1—0,2 мл, морским свинкам — внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2—0,5 мл. За животными наблюдают 5—7 дней.
В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2—3 "слепых" пассажа. Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.