Визначення кількості мікроорганізмів методом

Культивування

Зміст завдання: визначити вміст мікроорганізмів на вказаному викладачем об’єкті (стіл, тарілка, ніж та ін.), у продукті (борошно, сіль, хліб, дріжджі та ін.) або в повітрі.

Визначення кількості мікроорганізмів методом культивування проводиться за такими етапами:

1) підготовка вказаного матеріалу для дослідження;

2) приготування десятикратних розведень матеріалу;

3) висів у чашки Петрі;

4) підрахунок вирощених колоній (проводиться на наступному занятті).

 

Підготовка матеріалу до дослідження

Характер підготовки матеріалу для дослідження залежить від його природи і властивостей:

1. Матеріал – твердий продукт, нерозчинний у воді (хліб, сир, пе­­­чиво та ін.).

У цьому випадку зважується в стерильному посуді наважка продукту, взята з середнього його зразка. Розміри цієї наважки (0,5 – 2 г) визначаються ступенем забруднення продукту: чим він вищий, тим менша має бути наважка. Наважку переносять у стерильну ступку, заливають 1–2 мл стерильної води і ретельно розтирають стерильним макогончиком. Опісля всю цю масу переносять у колбочку або пробірку з визначеним об’ємом води (10 мл або 100 мл) і одержану таким чином вихідну суспензію ретельно розмішують.

2. Матеріал – твердий продукт, розчинний у воді (сіль, цукор та ін.).

Щоб приготувати вихідну суспензію, діють так: відважують наважку продукту і розчиняють її у визначеному об’ємі стерильної води.

3. Досліджуваний матеріал – рідина (наприклад, молоко, плодово-ягідний сік, безалкогольний напій, вода та ін.). Такий матеріал є готовою вихідною суспензією.

4. Матеріал – будь-яка поверхня (поверхня стола, бочки, котла та ін.).

У цьому випадку для приготування вихідної суспензії з поверхні досліджуваного предмета площею 100 см² (4 площі по 25 см²) знімають стерильним тампоном, змоченим у стерильній воді, мікрофлору, яка на ній міститься. Тампон вміщують у колбочку з визначеним об’ємом стерильної води (10–100 мл). Потім стерильним тампоном витирають цю поверхню і тампон вміщують в ту ж колбочку. Вміст колбочки ретельно розмішують для одержання вихідної суспензії.

5. Досліджуваний матеріал – газ (повітря).

У цьому випадку протягують визначений об’єм повітря через відомий об’єм стерильної води або рідкого живильного середовища. Можна також проводити визначення мікробної забрудненості повітря іншим способом, а саме: чашку Петрі з поживним середовищем переносять в досліджуване приміщення і відкривають її на 5–10 хвилин для осідання на середовищі мікроорганізмів.

Приготування десятикратних розведень

 

Вихідна суспензія звичайно містить велику кількість мікро­організмів, тому висів на неї дасть на чашках Петрі велику кількість колоній, підрахувати які практично неможливо. Щоб зменшити кількість мікроорганізмів при висіві, вихідну суспензію розводять стерильною водою у такій кількості, щоб посіви з цих розведень давали на чашках Петрі від 20 до 600 колоній. Це розбавлення або розведення, як прийнято його називати у практиці мікробіологічних досліджень, проводять таким чином: до пробірок наливають по 10 мл води і стерилізують в автоклаві (після стерилізації у кожній пробірці залишається майже по 9 мл води). Потім стерильною піпеткою беруть 1 мл підготовленої вихідної суспензії і вносять до пробірки зі стериль­ною водою; піпетку після цього промивають 2–3 рази водою з тієї ж пробірки. Так отримують перше розведення суспензії 1:10. Після цього новою стерильною піпеткою беруть з першого розведення 2 мл і вносять таким же чином в наступну пробірку з 9 мл стерильної води, тобто готують друге розведення – 1:100. Анало­гіч­ним чином готують 3, 4 і наступні розведення.

 

Висів у чашки Петрі

Якщо вміст мікроорганізмів у досліджуваному субстраті невідомий, то для висіву готують стільки стерильних чашок Петрі і пробірок з відповідним живильним середовищем (частіше вико­ристо­вують МПА, сусловий агар або МПЖ), скільки було приготовано розведень вихідної суспензії.

Перед висівом пробірки з середовищами вміщують на водяну баню і нагрівають до розплавлення твердого поживного середовища. Чашки Петрі виймають з паперу, в який вони були загорнуті при стерилізації, розміщують перед собою на робочому столі і пишуть на кришці порядковий номер, розведення, найменування досліджуваного об’єкта, дату посіву і прізвище працюючого.

Для висіву стерильною піпеткою (кожен раз новою) набирають по 1 мл ретельно розмішаної вихідної суспензії або відповідного її розведення. Потім злегка підіймають край чашки Петрі і вміст піпетки переносять на середину дна чашки. Туди ж виливають з пробірки розплавлене живильне середовище (охолоджене до 45°). Круговими рухами чашки ретельно змішують живильне середовище з висівним матеріалом і залишають для застигання (корок і край пробірки перед виливанням з неї живильного середовища в чашку Петрі фламбують, тобто проводять через полум’я спиртівки чи газового пальника).

Після застигання живильного середовища чашки з висівом на агарних середовищах перевертають догори дном і ставлять у термостат при потрібній температурі, а желатинові, не перевертаючи, витримують при температурі не вище 20–22°С.

Примітка. При повторному аналізі, коли вміст мікроорганізмів у досліджуваному субстраті вже приблизно відомий, висів з чашки Петрі роблять лише з трьох останніх розведень.