Визначення кількості мікроорганізмів методом
Культивування
Зміст завдання: визначити вміст мікроорганізмів на вказаному викладачем об’єкті (стіл, тарілка, ніж та ін.), у продукті (борошно, сіль, хліб, дріжджі та ін.) або в повітрі.
Визначення кількості мікроорганізмів методом культивування проводиться за такими етапами:
1) підготовка вказаного матеріалу для дослідження;
2) приготування десятикратних розведень матеріалу;
3) висів у чашки Петрі;
4) підрахунок вирощених колоній (проводиться на наступному занятті).
Підготовка матеріалу до дослідження
Характер підготовки матеріалу для дослідження залежить від його природи і властивостей:
1. Матеріал – твердий продукт, нерозчинний у воді (хліб, сир, печиво та ін.).
У цьому випадку зважується в стерильному посуді наважка продукту, взята з середнього його зразка. Розміри цієї наважки (0,5 – 2 г) визначаються ступенем забруднення продукту: чим він вищий, тим менша має бути наважка. Наважку переносять у стерильну ступку, заливають 1–2 мл стерильної води і ретельно розтирають стерильним макогончиком. Опісля всю цю масу переносять у колбочку або пробірку з визначеним об’ємом води (10 мл або 100 мл) і одержану таким чином вихідну суспензію ретельно розмішують.
2. Матеріал – твердий продукт, розчинний у воді (сіль, цукор та ін.).
Щоб приготувати вихідну суспензію, діють так: відважують наважку продукту і розчиняють її у визначеному об’ємі стерильної води.
3. Досліджуваний матеріал – рідина (наприклад, молоко, плодово-ягідний сік, безалкогольний напій, вода та ін.). Такий матеріал є готовою вихідною суспензією.
4. Матеріал – будь-яка поверхня (поверхня стола, бочки, котла та ін.).
У цьому випадку для приготування вихідної суспензії з поверхні досліджуваного предмета площею 100 см² (4 площі по 25 см²) знімають стерильним тампоном, змоченим у стерильній воді, мікрофлору, яка на ній міститься. Тампон вміщують у колбочку з визначеним об’ємом стерильної води (10–100 мл). Потім стерильним тампоном витирають цю поверхню і тампон вміщують в ту ж колбочку. Вміст колбочки ретельно розмішують для одержання вихідної суспензії.
5. Досліджуваний матеріал – газ (повітря).
У цьому випадку протягують визначений об’єм повітря через відомий об’єм стерильної води або рідкого живильного середовища. Можна також проводити визначення мікробної забрудненості повітря іншим способом, а саме: чашку Петрі з поживним середовищем переносять в досліджуване приміщення і відкривають її на 5–10 хвилин для осідання на середовищі мікроорганізмів.
Приготування десятикратних розведень
Вихідна суспензія звичайно містить велику кількість мікроорганізмів, тому висів на неї дасть на чашках Петрі велику кількість колоній, підрахувати які практично неможливо. Щоб зменшити кількість мікроорганізмів при висіві, вихідну суспензію розводять стерильною водою у такій кількості, щоб посіви з цих розведень давали на чашках Петрі від 20 до 600 колоній. Це розбавлення або розведення, як прийнято його називати у практиці мікробіологічних досліджень, проводять таким чином: до пробірок наливають по 10 мл води і стерилізують в автоклаві (після стерилізації у кожній пробірці залишається майже по 9 мл води). Потім стерильною піпеткою беруть 1 мл підготовленої вихідної суспензії і вносять до пробірки зі стерильною водою; піпетку після цього промивають 2–3 рази водою з тієї ж пробірки. Так отримують перше розведення суспензії 1:10. Після цього новою стерильною піпеткою беруть з першого розведення 2 мл і вносять таким же чином в наступну пробірку з 9 мл стерильної води, тобто готують друге розведення – 1:100. Аналогічним чином готують 3, 4 і наступні розведення.
Висів у чашки Петрі
Якщо вміст мікроорганізмів у досліджуваному субстраті невідомий, то для висіву готують стільки стерильних чашок Петрі і пробірок з відповідним живильним середовищем (частіше використовують МПА, сусловий агар або МПЖ), скільки було приготовано розведень вихідної суспензії.
Перед висівом пробірки з середовищами вміщують на водяну баню і нагрівають до розплавлення твердого поживного середовища. Чашки Петрі виймають з паперу, в який вони були загорнуті при стерилізації, розміщують перед собою на робочому столі і пишуть на кришці порядковий номер, розведення, найменування досліджуваного об’єкта, дату посіву і прізвище працюючого.
Для висіву стерильною піпеткою (кожен раз новою) набирають по 1 мл ретельно розмішаної вихідної суспензії або відповідного її розведення. Потім злегка підіймають край чашки Петрі і вміст піпетки переносять на середину дна чашки. Туди ж виливають з пробірки розплавлене живильне середовище (охолоджене до 45°). Круговими рухами чашки ретельно змішують живильне середовище з висівним матеріалом і залишають для застигання (корок і край пробірки перед виливанням з неї живильного середовища в чашку Петрі фламбують, тобто проводять через полум’я спиртівки чи газового пальника).
Після застигання живильного середовища чашки з висівом на агарних середовищах перевертають догори дном і ставлять у термостат при потрібній температурі, а желатинові, не перевертаючи, витримують при температурі не вище 20–22°С.
Примітка. При повторному аналізі, коли вміст мікроорганізмів у досліджуваному субстраті вже приблизно відомий, висів з чашки Петрі роблять лише з трьох останніх розведень.